作者：诺恒分析 　　

　　

　　介绍 　　

　　

　　详细介绍了对氨基苯磺酸酯的主要杂质。 　　

　　

　　摘要 　　

　　

　　在制药工业中，磺酸或磺酰卤试剂常用作烷基化试剂和催化剂，也常用于药物化学合成的纯化或成盐步骤。合成或重结晶步骤中任何残留醇的存在都可能导致磺酸盐的形成。临床研究发现，磺酸盐能直接与生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)发生烷基化反应，可能导致DNA突变。甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯和甲基磺酸异丙酯已被证明具有遗传毒性，而其他带有磺酸基团的物质可能具有潜在的遗传毒性，对人体健康构成威胁。因此，研究各种分析技术对磺酸盐的检出限是非常必要的。对于这类基因毒性杂质的测定，除了灵敏度、选择性和样品基质干扰的挑战外，磺酸盐的高反应性也给分析方法的发展带来了困难。 　　

　　

　　根据取代基的不同，磺酸可分为烷基磺酸酯和芳基磺酸酯。烷基磺酸盐，如甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸异丙酯(IMS)、甲磺酸正丁酯(NBMS)等。芳基磺酸盐，如甲基苯磺酸盐(MBS)、乙基苯磺酸盐(EBS)、对甲苯磺酸盐(MP-TS)等。这些磺酸盐是通过将甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸与甲醇、乙醇或其它低级醇结合而形成的。如果药物的活性成分以烷基磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、羟乙基磺酸酯的形式存在，或者在药物合成过程中使用磺酸类试剂，磺酸酯就会作为潜在的遗传毒性杂质存在。 　　

　　

　　根据FDA和EMEA指南的要求，所有可能存在于原料药或药物中且在早期合成步骤中未被去除的基因毒性杂质都必须进行监控。对于基因毒性杂质，限量要控制在ppm级别，所以基因毒性杂质的标准比普通杂质要严格近100倍甚至1000倍。 　　

　　

　　 　　

　　

　　常见检测方法 　　

　　

　　直接进样法 　　

　　

　　烷基磺酸盐化合物沸点低，适合用气相色谱法测定。目前，欧洲药典(EP)已经给出了检测遗传毒性杂质的通用方法。气相色谱法检测活性成分中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯和甲磺酰氯。而常规GC法灵敏度低，难以满足痕量遗传毒性杂质的检出限要求。目前，常用GC-MS法测定磺酸盐杂质。芳基磺酸盐类化合物沸点高，不适合用气相色谱法测定，所以常采用高效液相色谱法测定。为了进一步提高检测的灵敏度，现在广泛使用LC-MS和LC-MS/MS方法。 　　

　　

　　衍生化法 　　

　　

　　为了进一步提高检测灵敏度，提高样品的稳定性，避免降解反应，可以对样品进行适当的衍生化，然后用GC-MS、LC-MS等方法进行分析，方便检测。在欧洲药典8.0中，以碘化钠为衍生试剂，采用HS-GC-MS法测定甲磺酸倍他司汀中的甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸异丙酯(IMS)。 　　

　　

　　以下提供两个案例供参考。 　　

　　

　　苯磺酸氨氯地平 　　

　　

　　氨氯地平(结构式见图1)是氨氯地平的苯磺酸盐，是一种长效钙通道阻滞剂，可用于治疗高血压。在氨氯地平的合成过程中，使用正丙醇或异丙醇作为溶剂，而在与苯磺酸成盐时，使用甲醇作为氨氯地平和苯磺酸的反应溶剂，使用乙醇作为最终的重结晶溶剂。因此，在整个合成过程中有可能形成具有潜在遗传毒性的甲基苯磺酸盐、乙基苯磺酸盐、丙基苯磺酸盐和异丙基苯磺酸盐(图2)。因此，有必要监测这些药物中是否存在这些化合物。该药物一般口服，每日最大剂量为10 mg，相应的四种遗传毒性杂质的总TTC水平为150 ppm。 　　

　　

　　因此，采用HPLC-UV法同时测定四种杂质。按照ICH指南的要求，对方法的检出限(LOD)、定量限(LOQ)、线性、精密度和准确度进行了验证。该方法灵敏度高，操作方便，无干扰。在该方法下，4种遗传毒性杂质的检出限分别为7ppm、11ppm、12ppm和9ppm，能够满足检测要求。 　　

　　

　　 　　

　　

　　图1. 苯磺酸氨氯地平结构式 　　

　　

　　 　　

　　

　　 　　

　　

　　图2. 四种苯磺酸酯的来源 　　

　　

　　甲磺酸伊马替尼 　　

　　

　　甲磺酸伊马替尼(结构式如图3所示)是一种酪氨酸激酶抑制剂，FDA批准上市。用于治疗加速期、急性期和慢性期对干扰素耐药的胃肠间质瘤和慢性粒细胞白血病患者。在甲磺酸伊马替尼的合成过程中，需要将伊马替尼和甲磺酸分别溶于甲醇中，然后进行反应。反应结束后，除去甲醇，然后加入乙醇回流溶解，最后置于冰浴中结晶，得到成品。因此，在成盐和提纯过程中是可能的。 　　

会生成甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)(如图4)。MMS和EMS已经被证实具有遗传毒性和致癌性，尽管甲磺酸伊马替尼可以抑制癌细胞的生长，但MMS和EMS的基因毒性可能会增加用药的风险。依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对苯磺酸伊马替尼中的MMS和EMS进行定量分析。

　　

因此，利用GC-MS的方法进行检测，该方法在现有的方法上进行了优化，省去了衍生化复杂的操作步骤，直接进样检测。该方法选择正己烷为溶剂，解决了样品溶解度问题且无基质干扰，在该方法下MMS和EMS的检测限均为0.3μg/mL，两种杂质在1~15 μg/mL的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2>0.999，收率在98.1%~99.6%之间，符合检测的要求。

　　

　　

图3. 甲磺酸伊马替尼结构式

　　

　　

图4. 两种苯磺酸酯的来源

　　

总结

　　

磺酸酯类化合物作为潜在基因毒性杂质，从很多方面都可能引入，可以从以下几个方面考虑来进行管控：

　　

a.对起始物料(如甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、羟乙基磺酸)中是否含有烷基磺酸酯或芳基磺酸酯杂质进行检查

　　

b.对药物活性成分的生产过程进行监测，检查在甲磺酸、羟乙基磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸及相应的酰氯存在的情况下是否使用了低级醇

　　

c.确认生产过程中接触到磺酸类试剂的设备清洗程序中是否有涉及到低级醇的使用

　　

d. 在制剂过程中如制粒、压片时是否使用了低级醇等试剂。

　　

因此，杂质的研究必须要全面，这就要求我们对整个可能会产生的环节进行详细的控制，加强要求和监管，从而能够规避很多不可预见的风险。

　　

工艺控制是避免产生基因毒杂质的根本性解决方法，而方法检测则是一个概率性抽检的事情。将两者完美相结合，就能达到我们最终的要求。另外值得注意的是，同样的药物因合成工艺不同，则存在的基因毒杂质也不同，因此需要建立适宜的分析方法和质量标准来证实药物活性成分中的烷基磺酸酯或芳基磺酸酯杂质是否处于毒理学阈值(TTC，Threshold of Toxicological Concern)以下。