起点蛋糕 　　

　　

　　胃癌是最常见的消化道肿瘤之一。2020年，全球胃癌死亡人数约76.9万人，居恶性肿瘤死亡人数第四位。中国是胃癌大国，占全球胃癌新发病例的43.9%，死亡病例的48.6%。不幸的是，80%左右的胃癌患者属于局部进展期或晚期胃癌，中位生存期仅12-15个月. 　　

　　

　　氟尿嘧啶(5-Fu)联合铂类化疗仍是晚期胃癌的一线治疗方案。近年来，随着免疫治疗的快速发展，ICIs联合化疗作为晚期胃癌的一线治疗方案也迅速得到了美国食品和卫生局(FDA)的批准2，3。 　　

　　

　　然而，并不是所有的胃食管肿瘤患者都能从ICIs治疗中获益。最近的一项临床研究表明，ICIs不能改善PD-L1低表达患者的预后，这也提示了免疫治疗的效果与肿瘤本身的免疫微环境息息相关.基于此，肿瘤免疫微环境影响因素的研究逐渐成为该领域的热点。 　　

　　

　　近日，韩国成均馆大学医学院的Jeeyun Lee教授及其团队在著名杂志《癌症发现》上发表了最新研究成果。 　　

　　

　　他们通过对进展期胃癌患者一线化疗前后肿瘤组织的全外显子测序、RNA测序和单细胞测序分析，发现早期化疗可以重塑肿瘤的免疫微环境(TME)，而化疗效果差的患者往往伴随着LAG3细胞的增多和树突状细胞的减少。 　　

　　

　　这项研究不仅揭示了如化疗效果较好的肿瘤组织出现NK细胞富集、M1型巨噬细胞复极化、效应T细胞浸润等；. 　　

　　

　　 　　

　　

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　　之前的研究发现一线化疗对肿瘤免疫微环境的调控作用，也为胃癌的综合治疗提供了新的思路是6，7，但是还没有发现明确的临床证据。因此，Jeeyun Lee教授团队开展了这项研究，结合胃癌患者化疗前后肿瘤样本的高通量测序数据，探讨化疗对肿瘤免疫微环境的调节作用。 　　

　　

　　这项研究包括2018年11月至2019年5月在三星医疗中心就诊的12名晚期胃癌(AGC)患者。没有一个病人在加入这个小组之前接受过化疗。患者的中位年龄为56岁，包括EBV阳性和高微卫星不稳定性(MSI-H)的铂类等细胞毒性药物可能通过影响肿瘤免疫细胞PD-1的表达，促进免疫细胞的浸润，进而重塑大肠癌的免疫微环境.患者不包括在内。治疗前，对12例患者的所有原发病灶进行活检，并进行全外显子测序(WES)和全转录组测序(WTS)。此外，研究人员选择了11名患者的组织进行单细胞测序(ScRNA-seq)。 　　

　　

　　所有患者入组后均接受一线化疗：7例HER2阴性患者接受XELOX化疗(奥沙利铂130 mg/m2，静脉滴注，D1；卡培他滨1000mg/m2口服，bid，D1-14；Q3W)；而HER2阳性的5例AGC患者用XP曲妥珠单抗治疗(顺铂80mg/m2，静脉滴注，D1；卡培他滨1000mg/m2口服，bid，D1-14；曲妥单抗14毫克/公斤，D1；Q3W). 　　

　　

　　化疗2个周期后，对患者的疗效进行评估，5名（41.7%）为HER2阳性，7名（58.3%）患者为PD-L1阳性患者.研究员也对化疗后的肿瘤标本进行活检，并尽量选择与第一次活检相似的位置。然后，五个肿瘤样本被送到韦斯和WTS，七个送到ScRNA-seq。入选患者的诊断和治疗安排如图1A所示。 　　

　　

　　在分析WES数据后，他们发现治疗前后肿瘤都存在体细胞突变，其中治疗前肿瘤样本中有1454个碱基替换和49个碱基插入。处理后的样品含有534个碱基替换和18个碱基插入。此外，肿瘤中还存在基因组蛋白修饰和转录因子的基因突变，这也与早前报道的TCGA数据库中胃癌患者的基因突变一致(图1C-D)。治疗前后肿瘤组织中存在TP53、PIK3CA、APC、ELF3、MACF1、ARID2和MSH3基因突变，提示有5名患者为部分缓解（PR，响应型）；而余下7名患者（无响应型）中，3名为疾病稳定（SD），4名为疾病进展（PD）. 　　

　　

　　通过进一步分析两组肿瘤的突变特征，研究人员发现两组中的大部分单核苷酸替换为C:GT:A转换。WES和WTS测序结果显示，两个周期化疗后，AGC患者的基因组变化不显著，说明它们不是影响肿瘤免疫微环境的主要因素。 　　

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图1：研究入组流程及入组患者的基因组特征

　　

　　

接下来，研究人员对化疗前后的RNA-seq数据进行分析，并将肿瘤组织的免疫亚型分为四类：免疫缺失型、纤维化型、免疫富集型及免疫富集/纤维化型。所有肿瘤患者化疗前的TME组成并无明显差异，而在经历2个周期化疗后，基因组变异分析（GSVA）发现与M2型巨噬细胞（主要发挥抗炎、免疫抑制作用）分化相关的基因显著受抑制（P=0.009）；此外，PD-1通路相关的基因被明显激活（P=0.033），尤其是在响应型患者中（图2A-B）。

　　

　　

研究人员进一步分析了治疗前（n=11）及治疗后（n=7）肿瘤组织的scRNA-seq结果，并鉴定出7种主要的细胞亚群：上皮细胞，间质细胞，T细胞，自然杀伤（NK）细胞，髓样细胞，B细胞，血小板及未分类细胞。他们发现T细胞比例在化疗后的肿瘤中有增加趋势，对于响应型患者而言，效应CD8 T细胞在化疗后的中位百分比（46.1%）也明显高于化疗前（39.5%）。另一方面，在无响应型患者中，化疗后耗竭T细胞的中位百分比（14%）也高于化疗前（10.5%）。相比于响应型患者，无响应型患者中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的中位比例明显升高（79.1%），而在化疗后又进一步升高（86.7%）（图2C-D）。

　　

　　

为了明确化疗对肿瘤微环境中T细胞的调控机制，他们对化疗前后的上皮细胞中免疫信号通路的变化进行分析。结果发现化疗后损伤相关分子模式家族（DAMPs）的代表性基因（如ANXA1、HMGB1）的表达均显著上调；此外，对于HER2阳性的患者而言，固有免疫信号通路中的相关基因（如cGAS、STING）的表达在化疗后也明显上调（图2E）。这些结果提示，传统化疗药物可能通过重组T细胞组分，及激活固有免疫细胞而重塑部分AGC患者的肿瘤免疫微环境。

　　

　　

　　

图2：化疗前后肿瘤组织信号通路及免疫微环境的变化情况

　　

　　

那么，抗原提呈细胞是否也参与免疫重塑的过程呢？为回答这个问题，他们将髓样细胞细分为5个亚型，并重点关注肿瘤相关巨噬细胞（TAM）这一亚型，结果显示在化疗前后该亚型细胞的差异表达基因高达1003个。其中促炎相关基因及MHC I类抗原递呈基因在化疗后显著上调；而抗炎分子在化疗后则明显下调（图3A-B）。除观察到基因的差异表达外，信号通路的变化趋势也与之类似（图3C）。

　　

　　

随后，研究者还对TAM的分化轨迹进行了重建，将表达单细胞样巨噬细胞分子标志物（CD14，FCN1）的细胞群作为分化起点，根据拟时序分析得到两种分化轨迹，一种为M2型巨噬细胞，另一种为M1型巨噬细胞。化疗前肿瘤组织中，M2型巨噬细胞的比例（91.9%）显著高于M1型巨噬细胞（8.1%）；而经历2个周期化疗后，M1型巨噬细胞比例显著增加（35.8%）。这一数据提示化疗药物也诱导了M1/M2的极化过程。

　　

　　

　　

图3：化疗对TAM分化的影响

　　

　　

为了验证化疗药物对TME的调控过程，研究人员又选择了另一个包含17名AGC患者的临床队列进行验证，所得结果也与前期研究结果相类似。

　　

　　

既然化疗药物能够重塑肿瘤的免疫微环境，那么对于不响应型患者而言，是不是因为化疗对T细胞（尤其是耗竭T细胞）调控效果不佳呢？

　　

　　

为证实这一猜想，研究者将T细胞细分为6个亚型：调节性T细胞（Treg）、原始CD4、增殖型T细胞、记忆CD8、效应CD8及耗竭CD8细胞。他们发现3名化疗耐药的患者（EP-05，EP-07及EP-08）均不表达PD-L1，而在化疗后也未检测到PD-L1的表达上调；有2名患者存在MET基因扩增，而这两名患者同时伴有TIGIT基因的富集，表明这两名患者中含有较高比例的终末分化型T细胞（图4A-B）。

　　

　　

接下来，研究人员对EP-07患者化疗前后的组织样本进行分析，该患者存在MET基因扩增，且在化疗后病情出现快速进展。多重免疫组化结果表明，该患者肿瘤组织在化疗前含有较高比例的CD11c+树突状细胞（DC）（12.2%）及CD8+淋巴细胞（22.1%）；而化疗后TME主要为巨噬细胞、肿瘤细胞、CD20+ B细胞（8.6%），而DC细胞含量明显减少（0.4%）。

　　

　　

而对EP-08患者的分析表明，化疗后肿瘤组织中LAG3+细胞比例（0.3%）及CD20+细胞比例（2.5%）均显著高于化疗前（LAG3+ 0.04%；CD20+ 1.03%）（图4C-E）。由此可知，不响应型患者的肿瘤组织化疗后几乎没有出现T细胞浸润，而LAG3的表达及B细胞浸润反而有所增加。

　　

　　

　　

图4：化疗后无响应患者TME的细胞特征

　　

　　

总的来说，这个研究首次在临床样本中证实：化疗可调控部分胃癌患者的肿瘤免疫微环境，进而影响肿瘤预后。

　　

　　

此外，对于部分不响应化疗的患者，其PD-L1表达较低，且化疗后出现LAG3+及CD20+细胞浸润，提示该组患者接受ICIs治疗的获益也很有限，仍需要开发新的治疗方案。

　　

　　

　　

化疗药物重塑TME的机制猜想图

　　

　　

需要注意的是，本研究仍属于小样本量研究，而且关于化疗药物调控免疫细胞的分子机制也尚未明确，关于化疗与免疫微环境的调控网络仍需要更多的研究加以证实。