以分子生物学技术为依托的分子诊断学已成为临床医学的前沿学科，在遗传病、肿瘤等疾病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。分子诊断主要检测核酸，包括DNA和RNA。利用核酸杂交的原理，引物和探针是常用的工具。目前基于临床检测的技术和方法有突变/变异检测、DNA测序、生物芯片、PCR、FISH、毛细管电泳、质谱等。 　　

　　

　　 　　

　　

　　分子诊断常用的第一个工具是引物，它是DNA复制的起点，提供3’-OH，由一段短的单链DNA或RNA组成。一般来说，RNA片段存在于自然界，人工合成的DNA引物用于体外的DNA复制。PCR是聚合酶链式反应，即DNA复制的过程。它需要模板、正向和反向引物、酶、缓冲系统、dNTP(四种不同的脱氧核苷酸)，以及一定的温度控制时间程序来完成每一次DNA复制。 　　

　　

　　那么PCR过程中最重要的就是引物的设计，一般遵循三个原则：1。引物和模块是互补的；2.避免引物间形成稳定的二聚体和发夹结构；3.尽量避免模板中引物的非特异性结合。 　　

　　

　　通常，该位置选自其基因组的保守区域，该区域由20-30个长度的寡核苷酸组成。引物之间没有二级结构，四个碱基随机分布。3’端避免重复GC序列，Tm值在72左右。两条引物的Tm值不能相差太大，Tm=4(G C) 2(A T)，引物3'-OH不能修饰。 　　

　　

　　分子诊断中使用的另一种常用工具是探针，它是一种人工设计的寡核苷酸，与靶核酸杂交，以识别和检测靶核酸。标记了一些探针，如生物素、地高辛、荧光分子、辣根过氧化物酶等。主要有DNA探针、RNA探针、其他肽核酸和锁核酸探针。 　　

　　

　　探针的设计对杂交检测非常重要，而影响检测特异性的最重要因素是探针的长度。探针越长，特异性越高，但合成难度越大，成本也越高。一般有两种探针，一种是长度为500-5000bp的长探针，一种是长度小于500bp的短探针，对点突变和多态性检测比较敏感。有两种探针：非放射性的和放射性的。 　　

　　

　　实时荧光PCR检测试剂 　　

　　

　　实时荧光PCR是动态检测PCR过程中荧光强度的变化，获得PCR扩增的动力学曲线，从而实现对模板的定性或定量分析。主要有两种实现方式，一种是荧光探针，另一种是荧光染料。荧光探针的种类主要包括5’-水解探针(TaqMan探针)、分子信标、杂交探针和置换探针。荧光染料包括溴化乙锭、SYBR Green I、LC Green和SYT09。 　　

　　

　　实际疾病的实时PCR检测主要包括遗传病、传染病和肿瘤。传染病主要是病毒性肝炎、性传播疾病和结核病，它们的检测受到靶基因数量的限制。在目标基因的选择上，需要满足一些条件，如高特异性、相对序列保守性、目标基因的拷贝数、形态因素等。 　　

　　

　　实时PCR试剂的研发重点主要包括样品制备、阳性对照及其类型、绝对和相对定量方法、实时PCR扩增体系的优化。样品制备无非就是液化、裂解、核酸回收。阳性对照的选择需要最大限度地模拟真实样本中目的基因的环境和状态，且稳定不易降解。公认的RNA阳性对照是被MS2噬菌体修饰的armor RNA。同样，DNA阳性对照也可以制成铠甲DNA，用M13噬菌体修饰。在实时PCR中，模板定量可分为相对定量和绝对定量。绝对定量是指获得样本中靶基因的绝对数量，如检测患者血清中的病毒载量；定量是指获得样品中靶基因相对于参比样品中靶基因的相对数量，如肿瘤样品中基因表达水平的变化。实时PCR需要优化反应条件以提高扩增效率，这可以通过调整扩增片段的长度、各组分的浓度和扩增反应的程序来实现。 　　

　　

　　核酸杂交诊断试剂 　　

　　

　　杂交技术是遗传学研究和基因诊断的常用方法。包括反向点杂交和荧光杂交。反向斑点杂交是将待测探针分别交联在硝酸纤维素膜或尼龙膜上并编号，然后与待测DNA样品杂交。由于待测DNA样品具有生物素标记，探针结合后，杂交信号可通过颜色反应反映出来。反向斑点杂交具有许多优点，如同时检测和筛选多个样品，膜条制备时间短，使用非放射性标记引物，避免同位素半衰期引起的稳定性问题。常用的缓冲系统是柠檬酸钠缓冲液。常用的添加剂，硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸钠盐、甲酰胺等。被选为杂交促进剂。此外，在研发中还应特别注意探针的标记方法、杂交膜的选择、反应体系和条件的优化。 　　

　　

　　荧光原位杂交技术是一种在细胞遗传学水平上检测染色体、基因数目和结构异常的分子生物学技术。研发鱼类诊断试剂的前提是获得理想的探针和高效的标记。探针标记有放射性标记和非放射性标记，非放射性标记可分为直接法和间接法。直接法使用酶反应或化学合成来直接标记核酸探针上的荧光素基团。间接标记是先用生物素标记的DNA探针，再与荧光素亲和素或链霉素亲和素杂交进行检测。根据临床用途的不同，FISH探针主要分为基因探针、着丝粒探针和染色探针。 　　

　　

　　DNA测序检测试剂 　　

　　

　　测序技术的不断迭代更新，使得测序结果更快更准。桑格法作为第一代测序技术，也 　　

称为双脱氧核糖核酸末端终止法，测序步骤包括模板分离，循环测序，测序产物纯化，毛细管电泳，数据分析等。Sanger法测序虽准确度高，但是一次测序长度仅为300-1000bp，通量低，速度慢导致第二代测序技术应运而生，采用微循环阵列合成测序法。具备低成本高通量特点，有全基因组测序，靶向重测序，ChIP测序，RNA测序，mRNA测序，总RNA测序，靶向RNA测序，小RNA测序等。目前二代测序也是目前应用最广的测序技术，随着技术的不断发展，三代单分子测序，四代纳米孔测序也在逐渐崭露头角。

　　

目前分子诊断试剂的研制已经成为世界范围内最为活跃的创新领域之一。在研发过程中首先需要经过对诊断试剂的临床需求分析，对技术原理的理解，和体系的设计，体系的优化和性能评价最后就是试剂盒的组装和临床试验评价及注册申报等环节。