摘要：建立了加压毛细管电色谱同时测定风味果蔬汁饮料中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸的方法。样品用10%乙醇提取，超声处理30分钟。流动相为80%乙腈-水(含0.05 mol/l H2PO4，pH 2.5)，电压为5kV。二极管阵列检测器检测波长为210nm，峰面积用外标法定量。结果表明，5种目标化合物在1.0 g/ml ~ 50.0 g/ml浓度范围内线性关系良好，检出限为0.20mg/kg ~ 0.30mg/kg，定量限为0.60mg/kg ~ 1.0mg/kg，加标回收率为90.5% ~ 95.7%。该方法操作简单，特异性强，灵敏度高，能够满足风味果蔬汁饮料中多种有机酸的检测要求。 　　

　　

　　关键词：化学压力分析毛细管有机酸果蔬汁饮料电色谱苹果酸调味料 　　

　　

　　作为一种有机酸食品添加剂，可以增强酸味，调节pH值。常用的有苹果酸、醋酸、柠檬酸。调味果蔬汁饮料是指在果蔬汁的基础上添加一些其他的食品辅料来调节口味。富含对人体有益的碳水化合物、维生素和矿物质，深受消费者喜爱。一般在风味果蔬汁饮料中添加苹果酸、柠檬酸等有机酸作为酸度调节剂，可以调节饮料的pH值，改善饮料的风味，延长产品的保质期。风味果蔬汁饮料中有机酸的缺乏或过量会导致味道不协调，因此有必要检测和监控有机酸在此类产品中的使用情况。5，6 　　

　　

　　在风味果蔬汁饮料的研究中，对其营养成分的检测研究较多，但对相关有机酸的检测研究较少。参考相关有机酸的检测方法，主要有离子色谱法7、8、9、10，气相色谱法11、12，高效液相色谱法13、14、15，各有优势，但分析时间较长。加压毛细管电色谱(PCE)是一种新型电动式微分离技术，它结合了毛细管电泳的高效柱效和高效液相色谱的高选择性，具有两者的双重分离机理。与传统的高效液相色谱相比，加压毛细管电色谱除了压力流驱动外，还有电渗流驱动，柱效更高，分离速度更快，更适合复杂样品的多组分检测。本研究尝试将加压毛细管电色谱的双重分离机理与二极管阵列检测器的优势相结合，建立了风味果蔬汁饮料中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸5种有机酸的分析检测新方法，并对前处理方法进行了优化。所建立的pCEC-PDA检测方法操作简单，分析速度快，具有实用价值。 　　

　　

　　1.材料和方法 　　

　　

　　1.1仪器和试剂 　　

　　

　　200型加压毛细管电色谱系统和U3000二极管阵列检测器：美国Thermo Fisher科学公司。 　　

　　

　　草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸标准物质：国家标准物质中心。 　　

　　

　　1.2色谱条件 　　

　　

　　色谱柱：waterssunfirec18 (4.6mm 250mm，5 m)；流速：0.8毫升/分钟；样品体积：20微升 　　

　　

　　柱温：30；流动相为乙腈：水=80: 20(体积比)。 　　

　　

　　1.3测试方法 　　

　　

　　根据文献17、18和19中有机酸的分离条件，用亲水毛细管电色谱柱分离了五种有机酸。通过对流动相添加剂体系、电压强度分离条件、检测波长选择和预处理条件的优化，最终确定了风味果蔬汁饮料中5种有机酸分析的总体方法。 　　

　　

　　1.3.1流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响 　　

　　

　　在流动相(乙腈：水=80: 20，体积比)的基础上，向流动相中加入磷酸二氢钾(0.05mol/L，pH2.7)、偏磷酸(0.01mol/L，pH2.7)和磷酸二氢铵(0.05mol/L，pH2.7)，并调整流动相体系。 　　

　　

　　电压的影响 　　

　　

　　在加压毛细管电色谱的试验条件中，它是一个重要的试验参数。施加不同的电压强度会对样品的分离能力和分离速度产生不同的影响。在本实验中，施加0、2、4、5和8kV的直流电压来研究五种有机酸在不同电压强度下的分离。 　　

　　

　　1.3.3检测波长的选择 　　

　　

　　影响二极管阵列探测器灵敏度的关键参数一般是特征波长的选择。更好地选择特征波长将减少杂质峰对目标的影响，减少干扰。通常，当建立适当的二极管阵列检测方法时，需要优化该参数。 　　

　　

　　1.3.4标准曲线的制作 　　

　　

　　吸收一定质量的5种有机酸标准物质，配制成浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0g/mL的混合标准溶液，然后在仪器中进行分析，绘制标准曲线。 　　

　　

　　1.3.5样品预处理方法的优化 　　

　　

　　甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等。常用于液体样品提取溶剂。鉴于甲醇和乙醚的毒性，用磷酸和偏磷酸提取风味果蔬汁饮料时，提取液中酸阴离子的存在会影响有机酸的分离和测定。 　　

，因而综合考虑选择乙醇作为提取剂，并对提取剂的浓度进行优化选择。

　　

　　

不同提取方式对目标物的提取有很大影响，以10%乙醇作为提取剂，比较5种不同方式的提取效果。方式Ⅰ：样品提取剂加入调味果蔬汁饮品后直接离心（5000r/min,10min）；方式Ⅱ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后静置30min，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅲ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后均质，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅳ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后振荡30min，离心（5000r/min,10min）；方式Ⅴ：提取剂加入调味果蔬汁饮品后超声30min，离心（5000r/min,10min）。

　　

　　

1.3.6加标回收试验及样品的检测

　　

　　

以已知含量有机酸的调味果蔬汁饮品为基质，加入混合标准液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率，并以上述优化后的条件检测抽取的样品。

　　

　　

1.4数据处理

　　

　　

试验所有数据以平均值表示，采用Excel2013软件进行统计分析和绘图。

　　

　　

2、结果与讨论

　　

　　

2.1色谱条件的优化

　　

　　

2.1.1流动相添加剂对有机酸色谱行为的影响

　　

　　

有机酸在色谱系统中的分离是依据在色谱柱和流动相之间的分配系数不同而进行的，由于其组分极性较大，流动相中的水比例不能太高，否则有机酸会发生解离。为了能使5种有机酸在色谱系统中以分子形式存在，一般使用酸性流动相来进行组分的分离。本试验比较流动相（乙腈︰水=80︰20，体积比）中添加磷酸二氢钾（0.05mol/L,pH2.7）、偏磷酸（0.01mol/L,pH2.7）和磷酸二氢铵（NH4)2HPO4(0.05mol/L,pH2.7)3种添加剂<20,21>，研究对5种有机酸色谱行为的影响，结果见图1。

　　

　　

图1流动相组成对有机酸色谱行为的影响

　　

　　

a.磷酸二氢钾；b.偏磷酸；c.磷酸二氢铵；1.草酸；2.柠檬酸；3.酒石酸；4.苹果酸；5.乙酸。

　　

　　

由图1可知，3种添加剂体系对5种有机酸的色谱行为影响不同。随着流动相组成的不同，5种有机酸的保留时间也不相同，且峰形、分离度和响应信号均发生了较大变化。对比3个图可知，当流动相添加剂为磷酸二氢钾（0.05mol/L,pH2.7）时，5种有机酸能达到很好的分离效果；而流动相添加剂为偏磷酸（0.01mol/L,pH2.7）或磷酸二氢铵（0.05mol/L,pH2.7）时，5种有机酸并不能达到相应的分离效果，且检测基线不稳定、噪音较大。因此，本研究选择流动相添加剂为磷酸二氢钾。

　　

　　

2.1.2流动相添加剂pH值对有机酸色谱行为的影响

　　

　　

在流动相中加入0.05mol/L磷酸二氢钾，固定流速为0.8mL/min，柱温为30℃，4kV正向电压，用100mmol/L磷酸调节流动相添加剂的pH值，比较2.1、2.3、2.5、2.7、2.9五个不同pH值的流动相添加剂对5种有机酸组分保留时间和分离度的影响，结果见图2。

　　

　　

由图2可知，从保留时间上看，随着流动相pH值的增大，草酸、柠檬酸、酒石酸的保留时间延长，而苹果酸、乙酸的保留时间基本不受流动相pH值的影响。从分离度上看，随着流动相pH值增加，草酸、柠檬酸和酒石酸分离度越好。综合考虑保留时间和分离度，选择pH2.5的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相添加剂较佳。

　　

　　

图2流动相添加剂pH值对有机酸保留时间的影响

　　

　　

2.2电压强度的选择

　　

　　

在流动相中加入磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L,pH2.5），分别施加0、2、4、5、8kV正向电压，结果如图3所示。

　　

　　

图3电压强度对有机酸分离速度的影响

　　

　　

1.草酸；2.柠檬酸；3.酒石酸；4.苹果酸；5.乙酸。

　　

　　

由图3可知，随着电压升高，在电渗流的推动下5种有机酸的分离速度明显加快，同时色谱峰形变窄；当施加电压为+5kV时，样品分离时间加快到15min左右，苹果酸、乙酸的保留时间明显提前，并且5种有机酸样品完全分离。当施加电压达到+8kV后，分离速度无明显加快，并且仪器电流急剧增大，故本试验最终选择+5kV为施加电压。

　　

　　

2.3检测波长的选择

　　

　　

本试验采用二极管阵列检测器检测，在检测波长190nm～600nm范围内对5种有机酸的标准溶液进行全波长扫描<22,23>，根据各个组分的全波长扫描选择最大的吸收波长，结果见图4。

　　

　　

结果显示有4种有机酸在210nm波长附近有较大吸收，只有草酸在257nm和427nm波长处有较大吸收，综合考虑，选用210nm波长进行检测。

　　

　　

图45种有机酸的全波长扫描图

　　

　　

2.4标准曲线的制作

　　

　　

5种目标组分在1.0μg/mL～50.0μg/mL内均具有良好的线性关系，其中柠檬酸、酒石酸、苹果酸的检出限为0.20mg/kg，定量限为0.60mg/kg；草酸和乙酸的检出限为0.30mg/kg，定量限为1.0mg/kg，结果见表1。

　　

　　

表15种组分的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

　　

　　

2.5样品前处理方法的优化

　　

　　

2.5.1不同浓度乙醇溶液提取效果

　　

　　

图5为乙醇浓度分别为5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取剂时各有机酸组分含量的测定结果。

　　

　　

图5有机酸组分含量随提取剂配比变化情况

　　

　　

由图5可知，以柠檬酸为例，随着乙醇浓度的增加，提取液中柠檬酸检测含量呈现先增加后下降的趋势，在以10%乙醇作为提取溶液时，柠檬酸的含量能达到5.8mg/100g，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取时柠檬酸含量分别降低了34.4%和60.3%。样品中其他4种组分含量变化也类似，也表现为用10%乙醇溶液提取时含量最高，其他浓度的乙醇溶液为提取剂时，组分含量分别有不同程度的降幅。

　　

　　

2.5.2提取方式的选择

　　

　　

5种提取方式的试验结果如图6所示。

　　

　　

图6不同提取方式对有机酸测定结果的影响

　　

　　

由图6可知，以柠檬酸为例，提取方式Ⅴ显著高于其他4种提取方式；乙酸中方式Ⅴ和方式Ⅳ差异明显，但是明显高于方式Ⅲ、方式Ⅱ和方式Ⅰ；其他3种酸中也是提取方式Ⅴ的含量最高。由此可见，提取方式Ⅰ、提取方式Ⅱ和提取方式Ⅲ均有对目标物提取不完全的缺陷，而提取方式Ⅴ的效果优于提取方式Ⅳ的效果。因此，本方法选择提取方式Ⅴ即样品加入提取剂后超声30min，并离心（5000r/min,10min）的提取方式为适宜。

　　

　　

2.6加标回收率与精密度

　　

　　

以已知有机酸含量的调味果蔬汁饮品为基质，分别添加1.0、10.0、50.0mg/kg3个梯度浓度的有机酸标准混合溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复测定5次，测定结果见表2。

　　

　　

表2方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

　　

　　

由表2可见，5种组分3个水平的加标回收率为90.5%～95.7%，相对标准偏差（RSD）为2.3%～4.6%，表明本试验所建立的方法能够满足检测实际样品需要。

　　

　　

2.7实际样品测定

　　

　　

在市场上随机抽取5种调味果蔬汁饮品检测其中的有机酸，检测结果见表3。

　　

　　

表3样品中5种有机酸的测定（n=5)

　　

　　

由表3可以看出不同种类的调味果蔬汁饮品中含有的有机酸种类和含量差异较大，5款饮品中都含有苹果酸，而柠檬酸、酒石酸和乙酸这3种有机酸只有个别饮品中有，而草酸在这5种饮品中没有检出，整体有机酸检测到的种类与产品外包装标签中标出的一致。针对分析测定的结果，可以根据自身的需要，选用不同类型的调味果蔬汁饮品，来补充全面的或者单一的有机酸。

　　

　　

3、结论

　　

　　

本文利用加压毛细管电色谱-二极管阵列联用法，通过对流动相体系的组成、流动相添加剂的pH值、电压强度和检测波长的优化，以及样品提取液、提取方法的比较，建立了同时分离检测调味果蔬汁饮品中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸5种有机酸的亲水作用电色谱法。结果表明，采用WaterssunfireC18色谱柱，选择pH2.5的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相（乙腈︰水=80︰20，体积比）的添加剂，电压强度为+5kV，流速为0.8mL/min，柱温为30℃，检测波长为210nm的条件下，5种目标组分能在1.0μg/mL～50.0μg/mL内均具有良好的线性关系，检出限范围为0.20mg/kg～0.30mg/kg，定量限范围为0.60mg/kg～1.0mg/kg。样品加入10%乙醇提取并超声30min后，加标回收率能达到90.5%～95.7%,RSD为2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测调味果蔬汁饮品中的5种有机酸的含量，可为调味果蔬汁饮品中多种有机酸的分析和监控提供技术支持。