先说支原体的常规检测方法。 　　

　　养细胞的朋友最怕的恐怕就是细胞污染了。 　　

　　这种细菌和真菌的污染很容易分辨，虽然处理起来比较麻烦，但也不是不可能。相比较而言，支原体污染防不胜防。 　　

　　显微镜很难捕捉到它们。它们和细胞在同一个培养体系中共存，也和细胞抢食抢饮。可怜无助的细胞根本不是支原体的对手。他们只能生存，状态不如一代人，导致实验结果出现偏差。 　　

　　大多数情况下，如果发现细胞被支原体污染，直接扔掉，清理环境就行了。但在一些特殊实验中，如细胞种子保存、抗体药物生产、疫苗生产或细胞治疗等，需要常规检测细胞中的支原体，以保证细胞的纯度。 　　

　　支原体常规检测法之经典法 　　

　　这是指基于经典方法试剂盒的检测方法：VenorGem qEP。 　　

　　每个人都应该熟悉qPCR: 　　

　　实时荧光定量PCR 　　

　　定量实时PCR 　　

　　这是一种在DNA扩增中使用荧光化学物质在聚合酶链式反应(PCR)的每个循环后测量产物总量的方法。通过内部或外部参照方法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。 　　

　　在经典的支原体检测试剂盒中，不需要提取RNA和逆转录，样品只需要待检测的细胞上清液或从上清液中提取的DNA。 　　

　　经典法试剂盒：VenorGem qEP使用方法 　　

　　一、样品制备： 　　

　　浓缩:当细胞生长至90%时，可收集上清液用于检测，并可适当浓缩样品。 　　

　　注意：浓缩只适用于支原体的完整性，避免浓缩前支原体被破坏(如热灭活)。 　　

　　稳定:细胞培养样品中可能含有丰富的DNA酶，它们能在低温下降解支原体DNA。因此，建议稳定样品。如果立即进行DNA提取，则忽略该步骤。 　　

　　DNA 抽提:的大量证据表明，DNA提取可以达到最高的灵敏度。DNA提取的方法有很多，但要适合支原体基因组。我们建议： 　　

　　VenorGeM Sample Preparation kits （货号56-1010/-1050/-1200) 适合手动DNA抽提 　　

　　这些DNA提取试剂盒都经过了广泛的验证，具体流程见试剂盒说明书。此外，VenorGeM qEP试剂盒中包含的内控DNA质控品也用于验证DNA提取步骤(内控原理：已知浓度的细胞中含有内控DNA序列，该序列与任何现有的生物序列均不同源，对检测的DNA样品干扰最小。在DNA提取之前，将内部对照细胞和样品加入到细胞裂解溶液中并一起提取。内部对照DNA序列的成功扩增表明目标DNA的成功提取)。 　　

　　二、试剂制备与PCR 　　

　　注：具体参数设置请点击阅读原文，登录官网查询。 　　

　　此外，以下仪器已通过PCR反应验证： 　　

　　三、试剂制备与PCR 　　

　　FAM通道用于检测支原体荧光信号。根据DNA标准曲线和Ct值。具体步骤请参考具体qPCR仪器和软件的功能。我们建议评估包括质控品在内的每个样品的扩增曲线。 　　

　　CT & lt40是阳性。Ct40为阴性。支原体DNA和内参DNA对信号有竞争性抑制作用。支原体DNA越多，FAM通道信号越高，而内部对照的HEX通道信号越低。 　　

　　今天在这里介绍检测支原体的经典qPCR方法。