嘧啶核苷酸的从头合成是先合成UMP，再从UMP衍生CMP和dTMP。嘧啶环简单，所以合成步骤少，没有分支。相对而言，在嘌呤环合成过程中，组氨酸合成释放的AICAR可视为一个分支。
UMP合成途径。引自《医学生物化学》杂志
两种常见的分子用于合成UMP:氨基甲酰磷酸(CP)和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。前者是尿素合成的中间体，后者参与嘌呤、组氨酸和色氨酸的合成。不过，这两种分子的用途和以前略有不同。
PRPP作为嘌呤合成的初始“载体”，整个嘌呤环都是在磷酸核糖上合成的。但在UMP的合成中，后期加入了磷酸核糖，嘧啶环的合成从CP开始。这里，催化CP合成的酶是氨甲酰磷酸合酶2(CPS-2)，它位于细胞质中。CPS-1存在于尿素的线粒体中。
细胞质中氨甲酰磷酸的合成。引自《医学生物化学》杂志
CPS2催化谷氨酰胺和碳酸氢盐形成氨甲酰磷酸，消耗2 ATP。与CPS1相比，直接消耗相同，但CPS1的底物是氨。因为谷氨酰胺的合成还需要消耗ATP，所以这个反应消耗的比较多。它的优点是摆脱了对氨的依赖，可以在低氨浓度的细胞质中进行。
对人体来说，这两种CP还有一个区别：CPS1是一个独立的蛋白质，而CPS2是三功能蛋白质CAD的一部分。CAD将催化该途径前三步的酶活性结合成一条肽链，即CPSase、ATCase(天冬氨酸转氨酶)和DHOase(二氢乳清酸酶)，因此称为CAD。
人类CAD的基因结构和反应机制。引自结构。2016年7月6日；24(7):1081-94.
这种多酶融合可以提高催化效率，也是一种进化趋势。哺乳动物的脂肪酸合酶(FAS)也是如此。关于ATCase在原核生物中的活性，一些生物是单独催化亚基的三聚体，而另一些生物具有调节亚基或与DHOase结合。
不同原核生物的结构。引自结构。2016年7月6日；24(7):1081-94.
ATCase活性催化氨甲酰磷酸与天冬氨酸(氨甲酰磷酸可视为氨甲酰基的活性形式)反应生成氨甲酰天冬氨酸。PALA(N-膦酰基乙酰-L-天冬氨酸)是ATCase的过渡类似物，因此可以抑制CAD，是一种抗肿瘤药物。
DHOase的活性是催化氨甲酰天冬氨酸(CA)两端的羧基和氨基反应生成闭环二氢乳清酸(DHO)。Dh被二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)催化脱氢生成乳清酸。乳酸与PRPP反应形成乳清单磷酸(OMP)，然后脱羧形成UMP。
后两步反应也由双功能酶催化，其N端结构域具有乳清酸磷酸核糖转移酶活性，C端具有OMP脱羧酶活性，统称为UMP合成酶(UMPS)。
尿嘧啶能产生胞嘧啶，但这个反应只能在NTP水平上进行。因此，UMP首先与2分子ATP反应生成UTP，然后在CTP合酶(CTPS)的催化下与谷氨酰胺和ATP反应生成CTP。
CTP的合成。引自《医学生物化学》杂志
DNA合成所需的脱氧核苷酸通过还原相应的核糖核苷二磷酸获得，即通过还原NDP产生dNDP。催化这一反应的核糖核苷酸还原酶(RNR)是DNA合成和修复的关键酶，在调节DNA合成的总体速率方面起着关键作用。
Rn由自由基机制催化，根据自由基产生的方式可分为三种。第一类来自酪氨酸残基，第二类来自钴胺素腺苷，第三类来自糖基。RN被催化后，其关键巯基形成二硫键，需要还原成游离巯基。最终的电子供体都是NADPH，但电子传递中间有两个系统，即硫氧还蛋白系统(TRX)和谷氧还蛋白系统(GRX)。目前推测两个系统可以互为备份(World J Biol Chem。2014年2月26日；5(1): 6874.)。
核糖核苷酸还原酶系统。引自《医学生物化学》杂志
DNA需要的胸腺嘧啶是尿嘧啶甲基化生成的，甲基化是在dUMP上进行的。该反应由胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TYMS)催化，亚甲基四氢叶酸用作催化剂。
为甲基供体，生成dTMP。转甲基后四氢叶酸（THF）生成了二氢叶酸（DHF），需要由二氢叶酸还原酶（DHFR）催化其再生。dUMP可由UDP还原、脱磷酸生成，也可由dCMP脱氨生成。
dTMP的合成。引自themedicalbiochemistrypage
嘧啶核苷酸合成也有补救途径。尿嘧啶可与PRPP生成UMP，也可与1-磷酸核糖生成尿苷，再被尿苷激酶催化生成UMP。胞嘧啶不能与PRPP反应，但胞苷可被尿苷激酶催化生成CMP。碱基和脱氧核糖-1-磷酸可由磷酸化酶合成脱氧核糖核苷，再由脱氧核糖核苷激酶生成脱氧核糖核苷酸。
一些辅酶也属于核苷酸衍生物。NAD的合成是由烟酸与PRPP反应，生成烟酸单核苷酸，再与ATP缩合生成烟酸腺嘌呤二核苷酸，最后由谷氨酰胺酰胺化生成NAD。NAD激酶可催化其生成NADP。
FAD的合成是由黄素先与ATP生成黄素单核苷酸（FMN），再与ATP生成FAD。辅酶A的合成是由泛酸先与ATP生成4-磷酸泛酸，再与半胱氨酸缩合并脱羧生成4-磷酸泛酰巯基乙胺，与ATP缩合成脱磷酸辅酶A，最后被ATP磷酸化成辅酶A。
