重组聚合酶扩增(RPA)被称为可以替代PCR(由英国公司开发)的核酸检测技术。基于此的核酸扩增产物可在室温下15分钟内检测单分子核酸。该技术对硬件设备要求低，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。 　　

　　

　　苏州先达基因科技有限公司自主研发的酶重组等温扩增(ERA)，拥有全球自主知识产权。它能在低温(25-42)下特异性扩增痕量靶DNA片段。在35-40的最适温度下，扩增反应时间仅为15分钟，从而达到快速检测核酸的目的。该技术对硬件设备要求也较低，已应用于研究诊断、公共卫生、食品安全、水产畜牧等领域。 　　

　　

　　RPA和ERA的扩增引物是整个反应的关键，那么如何设计引物呢？ 　　

　　

　　1、RPA引物需要多长？ 　　

　　

　　RPA引物通常在32和35个核苷酸之间。在某些情况下，可以使用少于30个核苷酸的引物，但是扩增过程会明显变慢。 　　

　　

　　ERA 引物需要多长？ 　　

　　

　　为了充分利用ERA的检测速度和灵敏度，我们建议客户使用长度为29-32个核苷酸的引物。一般在ERA反应体系中可以使用PCR引物，但这些引物的检测速度和灵敏度可能不如较长的引物。 　　

　　

　　2、RPA引物应当相距多远？ 　　

　　

　　这取决于您的具体应用。标准试剂盒适用于不超过500bp的扩增产物。RPA扩增产物的大小没有下限，但RPA引物的扩增子一般需要超过80bp。扩增产物在100-200 BP之间，可以实现最快的RPA扩增。 　　

　　

　　ERA 引物应当相距多远？ 　　

　　

　　一般来说，我们建议两个ERA引物产生的扩增片段不要超过300bp。ERA的扩增片段大小可能没有下限，但根据ERA引物的最小长度，扩增片段的大小最低在80bp左右。为了获得最快的检测速度，最终扩增片段长度应为100-200bp。 　　

　　

　　3、RPA 我需要筛选多少引物？ 　　

　　

　　这取决于你对检测灵敏度的要求。例如，如果有成千上万的靶分子，大多数引物就足够了。如果灵敏度很高，最好进行系统的引物筛选。在筛选开始时，可能有10到20对候选引物。测试的引物越多，找到好引物的机会就越大。 　　

　　

　　ERA 我需要筛选多少引物？ 　　

　　

　　这取决于你对检测灵敏度的要求。例如，如果每次反应只需要检测1000个分子或更多，那么大多数引物对就足够了。对于极其灵敏的检测，最好进行系统的引物筛选，寻找好的ERA引物。在筛选开始时，测试的引物数量通常是正向7个引物，反向7个引物。测试的引物越多，找到可以检测单个分子的好引物对的机会就越大。 　　

　　

　　荧光型ERA产品探针设计 　　

　　

　　探针长度为46-52个核苷酸，其中至少30个位于THF位点的5’端，至少15个位于3’端。荧光团和猝灭剂只能标记在胸腺嘧啶(T)上，荧光团和猝灭剂之间的距离为2-5个碱基。THF取代了荧光团和猝灭基团之间的某个碱基，dT-荧光团或dT-猝灭基团和THF之间的核苷酸数目可以是0、1或2。应该在探针的3’端添加一个封闭基团。 　　

　　

　　试纸型ERA产品探针设计 　　

　　

　　探针长度为46-52个核苷酸，其中至少30个位于THF位点的5’端，至少15个位于3’端。THF只能标记在胸腺嘧啶(T)上，以取代位于荧光团下游30bp和封闭基团上游15bp之间的某个碱基荧光团。应该在探针的3’端添加一个封闭基团。 　　

　　

　　反应需要用多少引物？ 　　

　　

　　基础反应每次都需要480nM的引物，有时候，稍微改变一下引物的用量就可以提高性能。测试不同的引物浓度(从200纳米到600纳米)将有助于找到最合适的引物浓度。 　　

　　

　　反应需要用多少探针？ 　　

　　

　　通常，每个反应需要120nM的探针。然而，稍微改变探针的浓度有时可以促进反应。我们可以根据我们的具体应用，在一定的浓度范围内(从50纳米到150纳米)优化探针。 　　

　　

　　现成的PCR引物能用吗？ 　　

　　

　　可能不是爱国军。大多数PCR引物不能用于RPA。 　　

　　

　　一般在ERA反应体系中可以使用PCR引物，但这些引物的检测速度和灵敏度可能不如较长的引物。 　　

　　

　　现成的PCR探针能用吗？ 　　

　　

　　不能。大多数常用的PCR探针不适用于RPA或ERA反应。具体涉及一种利用聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统， 　　

这样的酶活性完全不兼容。

　　

　　

筛选引物的时候必须用探针么？

　　

不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。

　　

　　

引物筛选时应该用什么样的条件？

　　

引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件，例如模板的拷贝数、样本纯度等等。

　　

　　

给定引物的性能还能再提高么？

　　

一般来说，稍微改动一下引物的序列可以提高其性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化：以单核苷酸为基础略微改变引物的长度；或者保持引物长度不变，以1bp为基础移动引物的位置。经过了改动的引物，需要重新进行扩增活性的测试。

　　

　　

RPA引物的熔解温度应该是多少？

　　

RPA和ERA反应是在常温下进行的，DNA的解链与PCR有很大不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。

　　

　　

引物需要特别纯化么？

　　

在进行引物筛选的时候，一般不需要纯化。在其他情况下，引物的质量会造成批次间的差异。如果对一致性要求比较严格，最好先纯化引物再进行RPA或者ERA反应。

　　

　　

使用引物和探针的时候还需要注意些什么？

　　

引物和探针需要同时添加到体系中，一先一后会使片段重组出现偏向性。

　　

　　

我该如何选择探针？

　　

如果使用适用于探针的其中一种试剂盒，需要注意的是，在标靶区域选择探针位置时，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可帮助您设计备选检测 方案。

　　

　　

我如何配制冻干引物、探针？

　　

通常，用 TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）来制备 100μM 的储存溶液， 并长期储存于-20℃。