第一部分介绍了最基本的PCR反应和传统的分子克隆，包括内切酶、连接酶、外切酶、PCR扩增、转化等，是所有后续分子克隆的基础。如果说限制性内切酶克隆是入门水平，那么平端克隆和TA克隆就是初级水平。
PCR克隆
PCR克隆是PCR扩增后将目的基因直接连接到载体上的克隆技术。与传统的分子克隆相比，PCR克隆有其独特的优势，不需要寻找合适的限制性内切酶。不需要使目的基因与载体相容；需要较少的DNA等。但PCR克隆需要注意PCR引物和扩增条件，选择的克隆方法和使用的克隆载体。PCR的两种最简单的克隆方法是平端克隆和TA克隆。
平端克隆
将缺少突出端的插入片段连接到没有突出端的线性载体中，通过使用3’5’核酸外切酶或具有校对活性的高保真DNA聚合酶可以获得平端插入片段(平端修饰)。它们的校正活性可以提高扩增产物的序列准确性；然而，最大的问题是，当插入到平端克隆载体中时，连接效率低，并且不能定向克隆。
TA克隆
TA适合于克隆能扩增短DNA序列的耐热Taq DNA聚合酶。该酶缺乏3’5’校对活性，并具有末端转移酶活性，可将脱氧腺嘌呤添加到扩增子的3’末端(3’dA)。将获得的具有3’da突出端的PCR产物连接到含有突出的互补3’脱氧胸腺嘧啶(3’dt)突出端的线性TA克隆载体中。dA的加入可以用于常规的PCR反应，也可以在平端加入，取决于你的目的片段和使用的检测盒。比如在Takara的Mighty TA-cloning Kit中，3’端获得阿达碱基；prime star的Mighty TA-cloning reagent set中的DNA聚合酶具有很强的3'-5 '核酸外切酶活性，这将导致需要在平端添加一个额外的A碱基。
优点：不需要引物和特定的限制性位点序列，简单方便；
缺点：限制性内切酶的位置比较难判断，太长的片段会导致克隆效率降低。
TA克隆和平端克隆
TA克隆通用T载体
20年前，TOPO成为PCR克隆领域高质量和破坏性创新的代名词。时至今日，TOPO克隆试剂盒仍然是最快、最简单、最高效的克隆解决方案。拓扑克隆技术是上述技术的良好结合。如下图所示，TOPO流程更加方便、快捷、高效。
拓扑克隆载体的核心在于DNA拓扑异构酶I，它同时具有限制酶和连接酶的特性。Topisomerase I能特异性识别五核苷酸序列5’-(C/T)CCTT-3’，并能与连接在3-胸苷上的磷酸基团形成共价键。TOPO克隆类型与PCR产物和相应的克隆载体末端密切相关。主要分为TOPO TA克隆；克隆平端DNA零钝拓扑克隆法；定向拓扑克隆法克隆平端DNA。
托普克隆过程
随着技术的不断进步和对效率需求的不断提高，无缝克隆逐渐进入了大家的视野。相比之下，无缝克隆更简单灵活，几乎不受序列限制，一次最多可以定向组装10个dsDNA片段。接下来是我们的重点：无缝克隆。
与限制性内切酶克隆和PCR克隆相比，无缝克隆不会在年底或平端形成‘裂缝’，所以称为无缝克隆。在这一部分，我们主要谈论无缝克隆的基础，学校和市场上的产品。所依赖的简单原理为下面的应用提供了基础。
无缝克隆的分类
目前两个主流的无缝克隆是吉布森组装和金门组装。因为Gibson组装厂家多，方法精简，应用广泛，所以现在就来说说Gibson组装。如果有后续需要，我们再学习Gate。与传统的双酶切克隆一样，无缝克隆也需要插入目的片段，依靠dsDNA的粘性末端进行互补配对，利用DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成来修复缺口。本质上与前面介绍的PCR克隆相同，只是要求用PCR方法将目的片段的连接端与15-20bp载体连接位点的同源序列连接起来，然后将DNA片段和载体混合加入Master Mix进行连接，就完成了“无缝”克隆。
?k=克隆是什么意思简介,什么叫克隆是什么意思5.jpg">无缝克隆大致流程*综上我们发现最重要的部分就是Master Mix
一种外切酶，而不是之前的内切酶。从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样才能与另外的同源末端进行配对结合。因为是从5'端开始切除碱基，所以引物设计就非常关键了。特异性引物设计部分还是遵循着上一部分所讲的原则，而同源序列的设计可以按照下图所示原则进行设计。
同源序列引物设计
聚合酶负责碱基连接；连接酶负责DNA片段的连接。有意思的是，5'外切酶最适合温度是37℃，连接酶和聚合酶反应温度为50℃，三个酶在一个体系内，温度的控制使得DNA不会被剪切为ssDNA，同源序列引物序列>15bp，使得反应顺利进行。 Gibson Assembly最大的优势就是能够不受片段序列的限制、实现任意组装。因为是靠同源重组进行连接，所以没有必要去考虑限制性内切酶是否会切断目的片段；同时无缝地拼接多个片段，传统的酶切克隆，由于酶切位点有限能组装的片段数量是有限的。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔；能够节省时间。
这部分我们简单介绍了PCR克隆基础技术和无缝克隆的基础原理，分类以及优势。后面将具体介绍无缝克隆的流程，引物设计工具以及Snapgene的应用方式。
