最近开始了分子生物学中的质粒设计和构建实验，其中设计了无缝连接克隆。正好借着这个机会，一个菜鸟的学习之旅开始了。 　　

　　

　　1.最基本的PCR反应 　　

　　

　　聚合酶链式反应(PCR)是基于碱基互补配对的原理，通过温度的变化来控制DNA复制的三个主要步骤：变性、退火和复性。图1是最基本的PCR扩增循环的示意图。 　　

　　

　　图1。来自https://www.takarabiomed.com.cn/的PCR基本扩增过程(三步法) 　　

　　

　　1.Step1 DNA的热变性使DNA解螺旋成单链结构； 　　

　　

　　第二步退火，使单链DNA和引物通过碱基配对的原理结合； 　　

　　

　　第三步延伸，在DNA聚合酶的作用下，沿着引物的3’端合成互补链(退火和延伸也用于减少一步反应时间) 　　

　　

　　Step4再循环一次，一般25-35次。 　　

　　

　　要做到准确高效的放大，需要注意以下两点： 　　

　　

　　1.最重要的引物设计 　　

　　

　　引物设计往往需要注意40-60%的GC含量；一般长度在20bp左右；Tm在60左右；3’端不超过2g/c；避免形成二聚体结构/发夹结构。但对5’端的要求相对宽松，可以增加限制性位点、重组序列、磷酸化等修饰。最容易被忽略的一点是引物的浓度，但基本上公司合成的引物都会标注稀释后的最终浓度。引物设计有很多工具。比如if online、NCBI、ThermoFisher网站等。如果离线，引物总理，寡等。都很常见。如果有必要，可以单独谈。 　　

　　

　　2.DNA聚合酶选择 　　

　　

　　从最初的热稳定DNA聚合酶到热稳定TaqDNA，再到现在Takara、Thermo Fisher Scientific、天根等厂商的高保真TaqDNA(具有外切酶活性的DNA聚合酶，如图2所示)，结合热启动PCR(如图3所示，在热变性阶段，通过高温去除与DNA聚合酶结合的抗体，从而在退火阶段进行结合扩增，有效降低引物的非特异性结合和二聚体的影响)。 　　

　　

　　图2。赛默飞世尔科技公司官网的高保真聚合酶 　　

　　

　　图3。Takara官网热启动PCR 　　

　　

　　二。传统分子的克隆 　　

　　

　　在传统的分子克隆中，载体和目的DNA片段通过限制性内切酶匹配，片段通过连接酶连接形成表达目的片段的载体。图4显示了传统的克隆步骤。 　　

　　

　　图4。传统的分子克隆过程来自Shire官方网站，赛默飞世尔科技 　　

　　

　　1.载体的选择和制备 　　

　　

　　根据实验的目的和条件，选择合适的质粒载体，选择的质粒应具有基本结构，如可用于筛选蓝白lacZ基因是否构建成功；用于测试转化是否成功的AmpR抗性基因；常见的MCS多克隆位点等等。Addgene和Snapgene是两个非常有用的工具。举个简单的例子，你可以在addgene上查找pUC19或者ID号49793的具体序列，用Snapgene打开，基本特征就识别出来了。在酶列表中选择合适的限制性位点和酶进行线性化。 　　

　　

　　为了防止切割载体的自结合，有时可以将切割位点暴露的5’端去磷酸化，即通过酶去除碱基5’端的磷酸基团，这样可以有效降低非克隆所需的背景。 　　

　　

　　pUC19的质粒图谱 　　

　　

　　2.目标片段的制备和插入 　　

　　

　　目的该片段包括cDNA通过总RNA/mRNA的逆转录合成；GDNA；CDNA文库；质粒的另一部分等等，目的片段的扩增与第一部分介绍的PCR技术密切相关。 　　

　　

　　2.1通过双酶切插入目的基因 　　

　　

　　最基本的双酶切法以pUC19质粒为例。Snapgene的酶功能用于在多克隆位点MCS选择合适的酶。酶反应缓冲液和孵育条件是克隆成功的关键。同时，带有这两个限制性位点的目的基因片段将被限制性切割，并用专用试剂盒连接acc 　　

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有些情况找不到合适的酶，采用双酶切后将产生的末端平滑化/平端化即将载体和目的片段的的酶切位进行修饰使得粘性末端成为能连接的平末端。

　　

*补充：平端化的酶是大片段的 DNA 聚合酶 I 的大片段(“Klenow 片段”)和 T4 DNA 聚合酶。

　　

2.2 单酶切插入目的基因

　　

某些情况下，可能会选择一种内切酶同时切割插入片段和载体 DNA，以生成连接所需的互补末端。如果出现无法使用单一限制性内切酶的情形，可以考虑换用一对具有不同的识别序列的双酶，产生相匹配的末端进行连接。

　　

所有经过酶切或修饰的片段和载体可以用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，去除酶，盐等干扰成分，*注意：切胶过程中减少UV照射，防止DNA损伤。纯净的 DNA 的 A260/A280 比率约为1.8-2，A260/A230 比率约为 2。

　　

3. 连接

　　

将扩增酶切纯化的目的片段和酶切纯化的载体连接，构建完整的载体。Takara，Thermofisher，天根等公司都有相对应的试剂盒和标准化流程的说明书，按照protocol做即可。

　　

4. 转化

　　

转化是细菌细胞吸收外源DNA过程，感受态细胞是常用来做转化的。常见的(1)化学转化感受态细胞是使用氯化钙处理，将处理后的细胞与DNA载体共处理经过42℃热休克1min，后冷却冰浴2-3min，进行后续处理。感受态细胞的选择要根据实际需求来，DH5α，Top10等常用来做质粒的克隆扩增；蛋白表达研究，则菌株应具有 mRNA 稳定性和翻译功能，同时可以较高的重组蛋白表达诱导能力如天根的BL21(DE3)pLysS感受态细胞；还有用来构建DNA库的感受态细胞。(2) 电转化/电穿孔，利用高压脉冲电流击穿细胞，从而使DNA转入到细菌中，Takara，赛默飞都有商用的电转细菌细胞。

　　

5. 单克隆挑取

　　

转化过程中会遇到转化未成功的情况，包括载体未转入到细胞中；转入的载体不含有目的片段；转入了目的片段；转入载体包含了错误的片段等等。所以为了挑选正确的转化单克隆，常常需要多种手段鉴定。

　　

5.1 蓝白斑筛选

　　

所选的感受态细胞中表达突变的 lacZ 基因 (lacZΔM15)，该基因与质粒上编码的β-半乳糖苷酶 α肽段互补（ α互补）。将经转化的细胞涂布到含有 lacZ 转录诱导子、IPTG、 lacZ 显色底物 X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的生长培养基上。在蓝白斑筛选中，lacZ 会水解 X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当 DNA 插入片段破坏了载体编码的 lacZα 基因时，无法形成功能性 LacZ，经转化的菌落呈白色，白色单克隆菌落就是转化成功的菌株。

　　

图5 蓝白斑筛选过程 来自赛默飞官网

　　

5.2 抗性基因的筛选

　　

利用质粒载体本身带有的抗性基因进行有效的筛选，既方便又准确。

　　

而后续的目的片段PCR检验或者是质粒载体的测序验证也是必不可少的步骤。

　　

最后将质粒扩增，纯化，完成定量，即完成了一次最最基础的传统分子克隆。

　　

　　

这一部分具体回顾了无缝克隆前期的知识准备包括PCR和传统分子克隆，方便大家对于后面的无缝克隆的理解和接受。后续将持续更新，如有问题，欢迎大家交流讨论。