染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下将细胞内的DNA与蛋白质交联，通过超声波或酶处理将染色质切割成小块，然后利用抗原和抗体的特异性识别反应，沉淀出与目标蛋白质结合的DNA片段。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定、染色质破碎、染色质免疫沉淀、交联反应逆转、DNA纯化和DNA鉴定。 　　

　　

　　常见问题： 　　

　　

　　1.什么是1。芯片？ 　　

　　

　　答案：染色质免疫沉淀(ChIP)是一种研究体内蛋白质与DNA相互作用的技术。利用抗原抗体反应的特异性，能真实反映体内蛋白质因子与基因组DNA的结合情况。 　　

　　

　　2.2的应用有哪些。芯片？ 　　

　　

　　答案：近年来，由于该技术的不断发展和完善，其应用范围已经从研究目标蛋白与已知目标序列的相互作用发展到研究目标蛋白与全基因组未知序列的相互作用；从研究一个目标蛋白质与DNA的相互作用，到研究两个蛋白质与DNA的相互作用；从对启动子区组蛋白修饰的研究，到对与DNA序列结合的蛋白质复合物的研究。 　　

　　

　　3.3的原则。芯片技术？ 　　

　　

　　答案：在生理状态下，细胞内的DNA与蛋白质发生交联，染色质经超声波或酶处理切成小块后，通过抗原和抗体的特异性识别反应，沉淀出与目标蛋白质结合的DNA片段。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定、染色质破碎、染色质免疫沉淀、交联反应逆转、DNA纯化和DNA鉴定。由于芯片实验涉及步骤多，结果重复性低，所以芯片实验过程的每一步都要设计相应的控制，对结果的分析也需要一定的经验。 　　

　　

　　4.芯片测试一定要固定甲醛吗？ 　　

　　

　　回答：不一定，要看样本和测试方案。x芯片用来固定甲醛，N芯片用来固定甲醛。甲醛可以有效地交联蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA，形成生物复合物，从而阻止细胞内成分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于后续步骤对DNA和蛋白质的分析。加入甘氨酸可以终止甲醛的交联反应。 　　

　　

　　5.为什么一定要把DNA砍成至少1000bp大小(约3个核小体~400-500bp)？ 　　

　　

　　回答：保证芯片实验的良好精度。如果你的平均片段长度大于1000bp，你将分离出含有你的目标序列的DNA，但是待研究的蛋白质将距离你的目标序列700个核苷酸。 　　

　　

　　6.为什么要用三文鱼精子DNA封闭琼脂糖珠？为什么我的样本中三文鱼精子DNA没有PCR反应？ 　　

　　

　　答案：鲑鱼精子用于减少染色质DNA与琼脂糖珠的非特异性结合。实验者不太可能在三文鱼组织上做芯片实验，所以这个DNA不会因为交叉杂交而被PCR引物扩增。 　　

　　

　　7.最好的底漆设计是什么？ 　　

　　

　　答案：引物长度应为24个核苷酸，包含50%GC碱基对，Tm值为60 ,不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。没有必要考虑基因组中独特序列。 　　

　　

　　8.如何推荐从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白质-DNA复合物用于再芯片测试？ 　　

　　

　　答案：洗脱缓冲液可以在芯片分析试剂盒中找到。用它来洗脱复合物。对于重芯片，需要在免疫沉淀洗涤液和洗脱缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，以及第二次实验的稀释缓冲液。请确保所有溶液都处于低温，以便在收集第一次免疫沉淀复合物或第二次免疫沉淀时蛋白质不会降解。 　　

　　

　　9.蛋白A琼脂糖可以用于小鼠IgM吗？ 　　

　　

　　回答：蛋白A不能和小鼠IgM结合。可以考虑用桥接抗体来连接。 　　

　　

　　10.做芯片前有没有提纯细胞核的方法？ 　　

　　

　　回答：细胞用甲醛交联后，通过“膨胀缓冲液”培养和剪刀细胞匀浆(至少10倍体积)可以制备细胞核。 　　

　　

　　膨胀缓冲溶液： 　　

　　

　　25M Hepes，pH 7.8 　　

　　

　　1.5毫米氯化镁 　　

　　

　　10毫米KCl 　　

　　

　　0.1% NP-40 　　

　　

　　1毫米DTT 　　

　　

　　0.5毫米PMSF 　　

　　

　　蛋白质抑制剂混合物 　　

　　

　　然后根据方案在SDS裂解物中裂解。 　　

　　

　　11. 　　

　　

　　回答： 1。确保裂解物已在冰上放置至少10分钟。不要摇动或摇晃溶解产物，以避免气体饱和(产生气泡)。超声波会帮你做这个。 　　

　　

　　2.脉冲应该在10秒左右(与音量一致)。 　　

　　

　　3.如果样品体积小于400 uL，间隔应大于1分钟，EP管中更大体积的间隔应大于3分钟。 　　

　　

　　4.避免泡沫。确保超声波探头靠近液体底部(不要让探头碰到管壁)。 　　

　　

　　5.如果发现泡沫，立即停止超声波，放在冰上。旋转电生理管以去除泡沫，并继续超声。 　　

　　

　　6.在按下“开始”键之前，将探针放入液体中。 　　

　　

　　12.客户可以只用哺乳动物细胞的细胞核而不用整个细胞吗？ 　　

　　

　　回答：是的，其实细胞核比全细胞好。我们使用全细胞裂解液，因为它更简单，通常可以获得良好的结果。这个页面有一些相关信息： 　　

　　

　　13.13的最佳条件。芯片超声？ 　　

　　

　　回答： 1。确保溶解产物在冰中 　　

上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。

　　

2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。

　　

3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。

　　

4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。

　　

5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。

　　

6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。

　　

14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?

　　

答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:

　　

15.什么是input DNA? Output DNA?

　　

从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.

　　

其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.

　　

16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?

　　

抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。

　　

17.什么是reChIP技术?

　　

ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作