1983年，美国的Mullis首次提出了体外核酸扩增的想法，1985年，他发明了聚合酶链式反应(PCR)，这意味着PCR技术的诞生。1988年，斋祀等人从水生栖热菌中分离出一种耐热的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶，并成功地完成了DNA的自动扩增，使PCR成为一种方便而普遍的实用分子生物学技术。 　　

　　

　　 　　

　　

　　然而，随着常规PCR技术在分子生物学各个领域的广泛应用，常常出现样本量小、样本珍贵和非特异性扩增的现象。非特异性扩增的原因很多：常见的Taq DNA聚合酶最适温度为72，此时酶活性最好。低于这个温度，酶的活性较弱，所以低温下DNA聚合酶的活性导致错误的靶延伸和引物二聚体的形成；高保真酶热启动时也会发生非特异性扩增，主要与PCR的条件有关(Mg2，退火温度，循环次数等。).非特异性会导致目标扩增子产量低；目标扩增子的灵敏度下降；下游应用效果不佳等。. 　　

　　

　　今天，我们来谈谈如何成功扩增出我们需要的目标片段。 　　

　　

　　一、直接PCR 　　

　　

　　它是指直接从样品中扩增目标DNA，而不需要核酸分离和纯化。 　　

　　

　　在直接PCR中，在高温变性阶段，细胞和组织等物质在特殊的缓冲液中裂解，释放出DNA。因此，这种方法简化了实验过程，减少了动手操作时间，并且可以成为避免纯化过程中DNA的损失.菌落PCR鉴定今天在分子实验室中使用的直接PCR的最直接的体现。直接样品可以简单处理或稀释用于PCR反应。 　　

　　

　　 　　

　　

　　二、梯度PCR 　　

　　

　　梯度PCR和下降PCR都是用来优化反应体系中的退火温度，但原理不同。 　　

　　

　　梯度PCR是指在退火温度不明确的情况下，为了找到最优退火温度,在一台PCR仪上同时做多管PCR(需要支持梯度退火温度设置的PCR仪)，每管放在仪器中不同的列(有的在不同的行)，分别进行PCR(比如在50-60，可以有六管，分别为50、52、54、56、58)。 　　

　　

　　 　　

　　

　　何，凌娟，等。干细胞的遗传谱系追踪。自然协议13.10 (2018):2217-2246。 　　

　　

　　三、降落PCR 　　

　　

　　PCR反应中的许多成分，如引物、模板、Mg2、dNTPs等。会导致实验结果不准确。对于复杂的基因组DNA模板，普通PCR往往存在非特异性扩增，无法获得想要的理想产物。为了解决PCR非特异性扩增的问题,唐等人在1991年发明了PCR(触地PCR (TD-PCR)技术。 　　

　　

　　与温度梯度PCR相比，下落式PCR更具优势，因为梯度PCR需要多次反应或多管反应来选择合适的退火温度，而且即使通过多次实验找到了最佳退火温度，当更换其他PCR仪器进行相同扩增时，最佳退火温度也可能发生变化，因此需要重新探索最佳温度。而落地PCR只需一次反应即可获得良好的扩增效果，避免了每对引物最佳复性温度的优化和确定，大大削弱了仪器性能对扩增效果的制约。 　　

　　

　　原理 　　

　　

　　PCR反应中的退火温度会影响扩增结果。随着退火温度的升高，扩增特异性会变好，扩增效率会变低。PCR首先在高温下进行扩增，可以获得特异性扩增产物。目标基因丰度增加后，降低扩增温度可以提高扩增效率。当退火温度降至发生非特异性扩增的水平时，特异性产物将具有几何级数优势，在剩余反应中非特异的位点由于丰度低无法和特异位点竞争,因此产生单一的显性扩增产物。 　　

　　

　　退火温度设置 　　

通常降落PCR的退火温度范围可跨越15℃，从高于Tm值几度到低于其10℃左右，在每个温度上循环1-2个周期，然后在较低的退火温度上循环10个周期左右。

　　

　　

降落PCR应用

　　

降落PCR适用于经常更换引物的实验，在不知道Tm值，同时不想很麻烦的找出最佳Tm值的情况下，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。现在很多PCR仪具有设置降落PCR的程序，降落PCR在研究领域中已得到了广泛的应用。

　　

　　

注意事项

　　

降落PCR虽然有一定的优势，但它并非万能，降落PCR只能做到“锦上添花”，即能看见主带，但是存在杂带，可以利用降落PCR进行优化，但是如果连主带也看不见，只有杂带，那么用降落PCR也不会有很好的效果。

　　

　　

　　

四、巢式PCR

　　

　　

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，特异性的扩增位于首轮PCR产物内的DNA片段。

　　

　　

优势

　　

如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

　　

　　

实验步骤

　　

第一步：第一对绿色引物结合到DNA模板上，同时由于特异性不够，也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增产物。

　　

第二步：使用第二对黄色引物结合到第一步扩增的目的片段上进行第二轮扩增。由于第二对引物位于第一步PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

　　

　　

　　

最后祝愿大家新的学期实验顺利，文章接收，PCR势如破竹！