在对脱落酸的应答中鉴定新的miRNAs及其靶基因 　　

　　

　　材料和方法。用于测序的植物材料和样品制备在本研究中，使用野生拟南芥、哥伦比亚生态型(Col-0)和突变体abi1td、mapkkk17td和MAPKK18TD的种子。Abi1td 89、mkkk17 (SALK_080309C)和mkkk18突变体是通过T-DNA插入产生的，如前4节所述。在4层积两天后，植物在补充蔗糖的一半Murashige和Skoog基础培养基中生长。如89中所述，幼苗生长两周，然后用100微米ABA(溶于甲醇)或等效的模拟处理进行处理，然后培养皿在生长室中培养4小时。收获的植物材料在液氮中冷冻，并储存在-80的冰箱中，以备进一步使用。对于每种条件(模拟和ABA处理)，使用三个独立的生物重复，并根据制造商的方案(direct-zol RNA mini prep；ZYMO)，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取小RNA (Irvine，CA，USA)。ABA相关标记mRNA的扩增证实了ABA的应用。通过实时PCR分析检测标记mRNA的诱导或下调。所有测量都是在三个生物重复中进行的。使用Agilent 2100生物分析仪系统(Agilent，Santa Clara，ca，USA)来确认miRNA样品的RNA完整性(8)。 　　

　　

　　4.2.韩国首尔的Reads Macrogen Ltd的测序和处理使用Truseq小RNA文库制备指南(Part # 15004197 Rev.g protocol)在Illumina HiSeq2500平台上对miRNA进行测序，产生50 bp的配对末端读数。连接符被切断，没有连接符的读数和长度小于16 nt的读数被丢弃。然后，使用FASTX工具包过滤读数，要求至少95%的核苷酸具有20或更高的Phred质量分数。使用mirPRo独立管道90来执行读取编目。miRNA的鉴定使用ShortStack v-3.3 91进行，参数默认，但并不严格要求miRNA*的存在。由于每个样本的miRNA都是独立鉴定的，因此它们与Bedtools 92实用程序(https://bettools . readthedocs . io/en/latest/content/tools/merge . html，2018年10月30日访问)合并。此外，我们只保留在至少两个不同样品中鉴定的mirna，并且前mirna序列不短于40 nt。使用Bedtools筛选出miRNA*序列，找到独特的miRNA位点。使用默认的RNA structure版软件(https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html)用新的前体序列构建二级结构。使用miRbase数据库(2018年10月30日访问的http://www.mirbase.org/,第22版)进一步注释成熟的mirna，以识别保守的和新的mirna。原始测序数据(20 GB)存放在NCBI地球物理研究所，登记号为GSE172377。 　　

　　

　　4.3.差异表达分析使用DESeq2 package 93来分析原始计数，以找到具有差异表达的成熟miRNA。在我们的分析中，错误检测率为0.05，任何低于P调整值的成熟miRNA被定义为显著下调或上调。为了准备维恩图，使用在线网络工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)(2018年11月5日访问)来识别模拟和ABA之间共享的差异表达的miRNA。处理过的样品。类似地，通过将未处理的突变体对照样品(abi1td，mkkk17，mkkk18)与WT进行比较来研究突变体的效果。通过主成分分析来研究基因型之间的交互作用，以找出样本之间的方差。 　　

　　

　　4.4.根据制造商的方案(Direct-zol RNA Miniprep试剂盒，使用茎环QRT-PCR验证mirna表达；ZYMO Research Corporation，Irvine，California，U.S.A .)通过Tri-reagent从三种独立的生物体中提取。 　　

重复的总 RNA。 RNA 样品用 RNA Miniprep 试剂盒中提供的 DNaseI 处理以去除基因组 DNA。对于 qPCR 分析，使用 10 ng 总 RNA 从小 RNA 合成 cDNA。总共 1.5 L 10× 逆转录缓冲液、0.15 L 100 mM 三磷酸脱氧核苷酸、0.19 L RNase 抑制剂（20 单位/L）、1 L TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptase using TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI, Life Technologies, Carlsbad , CA, USA)，根据制造商的协议，在 15 L 反应混合物中使用了 3 L 茎环逆转录引物（ABI，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）。根据制造商的方案，使用 TaqMan Universal PCR Master Mix II 和尿嘧啶 N-糖基化酶（ABI, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）进行 TaqMan miRNA 检测。反应在 50°C 下进行 2 分钟（以获得最佳 UNG 酶活性），在 95°C 下进行 10 分钟，然后是 95°C 下 15 秒和 60°C 下 60 秒的 40 个循环。将所有 miRNA 初级转录本和其他转录本 cDNA 的 Ct 值标准化为 SnoR66 和 Actin8 TaqMan Assay cDNA 片段 Ct 值；两者都具有相同的 miRNA 表达趋势，因此 qPCR 结果显示使用 SnoR66 作为内源对照的结果。使用 2-ΔΔCt 方法计算相对转录水平的差异。每个样品重复3次PCR扩增，取2-ΔΔCt的平均值，通过Student's t-test确定基因表达的差异。以相似的结果进行了三个生物学重复，并显示了一个重复。 TaqMan miRNA 检测详细信息可在补充表 S1 中获得。4.5. Target Validation by 5′ RLM-RACE-PCR and miRNA Target Gene Expression by qRT-PCR通过 RNA 连接酶介导的 cDNA 末端快速扩增 (5' RLM-RACE)，对几种新型 miRNA 的靶 mRNA 切割位点进行了实验定位。使用 FirstChoice RLM-RACE Kit (ThermoFisher Scientific/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 对 5' RLM-RACE 进行修改后的程序。为了检查体内预测靶点的 miRNA 定向裂解，我们使用 Tri-reagent 从拟南芥幼苗中分离了总 RNA，如上所述。我们使用 5' RLM-RACE 试剂盒来扩增目标基因 mRNA 的 5' UTR。这些靶基因是根据新的miRNA靶基因的预测值（从0到3.5）选择的。在补充表 S1 中列出的 5' RLM-RACE 实验中使用了三种不同引物的组合。使用的总 RNA (10 g) 未经过小牛肠磷酸酶 (CIP) 和烟草酸焦磷酸酶 (TAP) 处理，miRNA 切割的 mRNA 不需要这种酶处理。然后使用 T4 RNA 连接酶将 RNA 与 RNA 接头（45 nt 长）连接。使用上述作为 RT-PCR 的模板，我们根据制造商的协议，在第一轮和第二轮 PCR 中使用 miRNA 目标特异性引物和接头引物扩增了 mRNA 的 5' 端。最终的 RLM-RACE 产品在琼脂糖凝胶上进行分析，并根据制造商的说明使用 DNA 凝胶提取试剂盒 (ThermoFisher Scientific/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 进行纯化。然后将扩增子克隆到 TA 克隆载体 pGEMT-easy (Promega, Madison, WI, USA) 并测序。为了量化新 miRNA 的已识别靶基因，使用已发表的协议 <89> 进行了 qRT-PCR，并稍作修改。使用 18S 作为内部对照计算基因表达的相对定量。使用 2-ΔΔCt 方法计算相对转录水平的差异。每个样品重复3次PCR扩增，取2-ΔΔCt的平均值，通过Student's t-test确定基因表达的差异。对所有靶基因进行了三个生物学重复。 qRT-PCR 分析中使用的所有引物均可在补充表 S1 中获得。4.6. Target Gene Identification, Gene Ontology, and KEGG Pathway Analysis使用在线服务器 psRNATarget (http://plantgrn.noble.org) 预测上调（|log2（倍数变化）| > 1 或下调 |log2（倍数变化）| < -1）已知和新型 miRNA 的推定靶基因 /psRNATarget/) <94> 使用默认参数。 对所有基因型的预测靶基因进行 GO 和 KEGG 富集分析，分别针对分子功能、生物学过程和细胞成分进行。 使用 ExPATH 数据库（http://expath.itps.ncku.edu.tw/rnaseq/enrichment/Arabidopsis/enrichment_analysis.php，2020 年 8 月 25 日访问）<95> 进行了 GO 富集和 KEGG 通路分析，以及富集 术语被可视化。 分别考虑 FDR（错误发现率）值 <0.05 和 p 值 <0.05 的 GO 术语和 KEGG 途径。