限制性内切酶的生物学功能来源于能够抵抗入侵细胞的外源DNA。细菌的限制-修饰系统使其自身的DNA碱基被甲基化和修饰，从而不被自身的限制酶识别和切割。 　　

　　限制性内切酶的发展 　　

　　沃纳阿尔伯(Werner Arber)在20世纪60年代初提出了一个想法：有一种酶可以切断病毒的DNA，以限制其增殖。 　　

　　肯威尔考克斯和汉密尔顿史密斯发现了第一个II型限制性内切酶Hind II，充分利用了限制性内切酶，Hind II可以准确地“执行”DNA1。同时，他们还发现甲基化酶可以被甲基化修饰，以保护细菌的原始DNA免受Hind II的攻击。 　　

　　凯瑟琳欧阳丹丹和丹尼尔那森斯研究了流感嗜血杆菌限制性内切酶对SV40 DNA的特异性切割2，得到了限制性内切酶图谱。 　　

　　丹尼尔那森斯、汉密尔顿史密斯和沃纳阿尔伯因在限制性内切酶方面的开创性研究获得了1978年的诺贝尔生理医学奖。 　　

　　到目前为止，科学家已经从原核生物中分离出多种限制性内切酶。限制性内切酶已经成为基因工程中一把重要的“手术刀”，并且已经商业化，广泛应用于基因工程中。 　　

　　限制性内切酶的分类 　　

　　根据亚基组成、识别位点、限制性位点、辅因子、作用方式等因素，限制性内切酶可分为三种类型，即型、型和型。 　　

　　表 1 限制性内切酶分类表 　　

　　I型和III型限制性内切酶没有实用价值，因为它们不能产生特定的切割片段。型限制性内切酶已经广泛应用于DNA分子克隆和序列分析，因为它不需要ATP来水解DNA，也不会通过甲基化或其他方式对DNA进行修饰。最重要的是，它们在识别序列中或附近切割双链DNA。 　　

　　型限制性内切酶的切割序列通常是4-6 bp的回文结构。这种酶有两种切割方式，一种是交错切割形成粘端，另一种是同一位置双链切割形成平端。 　　

　　型限制酶可进一步细分为IIP、IIA、IIB、IIC、IIS等。其中，型限制性内切酶能在其不对称识别位点下游特定距离切割DNA双链，因为这类限制性内切酶的识别序列和催化区被一个连接多肽隔开； 　　

　　IIS限制酶的一个突出特点是对切割位点的序列没有要求，即可以识别序列之外的任何核苷酸序列(常见的IIS限制位点见图1) 3。根据这一特性，在mRNA体外合成过程中，Poly（A）尾巴可以通过质粒DNA模板限制切割和转录获得，这一种方式能够在mRNA产品中加入特定数目的Poly（A）。 　　

　　IIS型限制酶克隆的优势： 　　

　　 单一管中进行克隆:由于连接产物中的切割位点消失，切割和连接可以在同一反应管中进行。 　　

　　 无痕克隆:不会引入冗余序列。 　　

　　通过使用正确的互补末端组合，可以同时装配 同时组装多个片段:多个片段。 　　

　　图1。常见的IIS限制性酶切位点 　　

　　限制性星号活性 　　

　　星号活性:是相同的限制酶。当某些反应条件发生变化时，酶的切割位点特异性发生变化，如酶浓度过高、反应溶液离子强度过低、pH值变化等。 　　

　　星号的大部分活动是可以控制的。一般在进行酶消化反应时，不需要考虑这个因素。只要在正常条件下使用酶提供的缓冲液，酶中就不会出现星号的活性。 　　

　　影响限制性内切酶活性的因素 　　

　　 DNA纯度：,中的杂质，如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等。会影响酶的活性，一般通过纯化DNA、增加酶量、延长孵育时间、扩大反应体系来提高。 　　

　　一般 DNA甲基化程度：大肠杆菌有两种甲基化酶修饰质粒，dam和dcm，甲基化酶的突变菌株必须用于基因工程。 　　

　　不同的限制性内切酶在 温度：的最适反应温度不同。大部分是37C，少数要求40-65C。 　　

　　 缓冲液：缓冲液是影响限制性内切酶活性的重要因素，市售的限制性内切酶通常都有专门的缓冲液。 　　

　　【参考文献】 　　

　　1 KELLY T J，JR .SMITH H O .流感嗜血杆菌中的限制性内切酶。二。《分子生物学杂志》, 1970年，第51卷第2期，第：页，第393-409页。 　　

　　2丹娜纳坦斯k。流感嗜血杆菌限制性核酸内切酶对猿猴病毒40 DNA的特异性切割。美国国家科学院学报，1971年，68(12): 2913-7。 　　

　　3张，王晓华，王晓华，等一锅，一步，具有高通量能力的精确克隆方法PLoS One，2008，3(11): e3647 .