逆转录实验是常见的分子生物学实验之一。虽然看起来步骤很简单，但是实际操作的时候会发现各种各样的问题。我相信你所有的朋友都被一个简单的反转录实验搞晕了。今天，边肖将为您介绍逆转录实验中的注意事项和常见问题。希望你能学以致用！ 　　

　　

　　 　　

　　

　　图1 逆转录过程 　　

　　

　　逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录实验包括三个要素，即引物、逆转录酶和RNA模板： 　　

　　

　　1. 引物：逆转录引物有三种，包括寡核苷酸引物(dT)、随机引物和基因特异性引物(GSP)。其中Oligo(dT)有12-20 T碱基，可与真核生物mRNA的3'Poly A尾配对合成全长cDNA，但只扩增带Poly A尾的mRNA，对模板质量要求高，适合克隆实验。随机引物，6-9个碱基，能随机识别并结合模板，适用于复杂结构和微模板，但特异性低，小片段多，适合后续qPCR实验。基因特异性引物可以识别特定的模板序列，具有特异性强、灵敏度高的特点，但需要合成特定的序列。因此，可以根据不同的实验要求选择相应的引物。 　　

　　

　　2. 逆转录酶：是一种纯化的禽髓母细胞瘤病毒(AMV)，由两个肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNase活性。其最适温度为42，最适pH为pH8.3，能消除高反应温度下mRNA二级结构对逆转录的阻碍，但高水平的RNase活性抑制了cDNA的产生，限制了其长度。另一种来自小鼠白血病病毒(M-MLV)，为单肽链，具有RNA聚合酶活性，RNA酶活性相对较弱。最适温度为37，最适pH为pH7.6。弱RNase活性非常有利于获得2-3kb mRNA的全长cDNA。 　　

　　

　　3. RNA 模板：通常用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。当整个总RNA进行琼脂糖凝胶电泳时，产生清晰的28S和18S rRNA条带(真核样品)。28S rRNA条带的强度应该大致是18S rRNA条带的两倍，没有gDNA和蛋白质残留。 　　

　　

　　 　　

　　

　　图2 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性 　　

　　

　　以上给大家简单介绍了逆转录的三要素。况且在实际操作过程中，会出现各种各样让我们措手不及的问题。下面为您详细解答！ 　　

　　

　　1. 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？ 　　

　　

　　确保模板RNA完整性好，没有DNA污染。 　　

　　

　　 RNA模板不应含有扩增抑制剂。 　　

　　

　　使用适量的模板RNA，模板太多会降低特异性，模板太少会导致无扩增带或带太弱。 　　

　　

　　如果模板中存在二级结构，可以通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 　　

　　

　　2. RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？ 　　

　　

　　逆转录抑制剂包括SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等。可以将鉴定出的高质量RNA模板样品混合，与高质量RNA模板的产量进行比较，检测RNA抑制剂；如果与样品混合后高质量模板RNA的产量下降，说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%(v/v)乙醇洗涤RNA沉淀，去除抑制剂。 　　

　　

　　3. 逆转录后的 qPCR 实验 Ct 值偏大或者普通 PCR 产量低。 　　

　　

　　RNA模板质量差，需重新制备RNA模板，琼脂糖凝胶电泳可检测质量。 　　

　　

　　反转录后的cDNA含有高浓度的模板RNA和反转录试剂，可能会抑制后续的PCR，所以可以通过适当的梯度增加cDNA的稀释比例(一般来说，原始cDNA溶液可以稀释5-10倍，最佳的模板加入量是扩增的Ct值为20-30个循环)。 　　

　　

　　初始RNA模板量低，需要降低稀释比或增加RNA模板量。 　　

　　

　　由于基因本身的原因(复杂性和长度)，复杂基因的引物可以重新设计，避免复杂的结构。或者使用三步程序或延长t的延长时间 　　

　　

　　如果逆转录或定量产品的性能较差，可以通过不同品牌的平行对比实验来比较逆转录产品的性能。 　　

　　

　　4. 逆转录酶扩增效率评估，应该关注哪些指标？ 　　

　　

　　建议：qpcr-CT值，或pcr产率 　　

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如果想比较逆转录性能，最为直接的还是后续做 qPCR 或者 PCR 平行对比实验，这种方法相对较为准确。

　　

不建议：cDNA 中间产物浓度测定 or 其他方法。

　　

逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生 RNA-cDNA 杂交链，溶液中的 RNA 和部分 DNA 会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不准确，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的试剂盒进行对比实验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。

　　

优化及注意事项

　　

① 逆转录 PCR 时，提取 RNA 是关键，需分离高质量 RNA（纯度和完整性）。

　　

② 整个操作过程需使用去 RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。

　　

③ 逆转录过程中要谨防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制剂。

　　

④ 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

　　

⑤ 逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。

　　

⑥ 提高逆转录预热温度（也可根据相应逆转录试剂盒进行调整）。

　　

⑦ 减少基因组 DNA 污染，可使用去基因组的逆转录试剂盒。

　　

（来源：先达基因（gendx.cn））