聚合酶链式反应(PCR)是20世纪80年代中期开发的体外核酸扩增技术。它具有特异、灵敏、高产、快速、简便、重复性好和易于自动化等突出优点。
一、 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)
PCR由三个基本反应步骤组成：变性-退火-延伸：
模板DNA的变性：模板DNA加热到93左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA解离下来，以便与引物结合，为下一步反应做准备；
模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA加热变性为单链后，降温至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对；
引物的延伸：DNA模板-引物偶联物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链。
重复变性-退火-延伸的循环，可以获得更多的“半保守复制链”，这个新链可以成为下一个循环的模板。
完成一个循环需要2 ~ 4分钟，目的基因扩增几百万次需要2 ~ 3小时。达到平台所需的循环次数取决于样品中模板的拷贝数。PCR的反应动力学重复PCR的三个反应步骤，DNA扩增的量呈指数增长。最终的DNA扩增可以通过Y=(1 X)n来计算.y代表扩增后DNA片段的拷贝数，X代表每次的平均扩增效率，N代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中，平均效率没有达到理论值。
在反应的初始阶段，靶序列的DNA片段的增加是指数级的。随着PCR产物的逐渐积累，扩增的DNA片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或平稳期，即出现“停滞效应”。这种效应称为平台期的数目、PCR的扩增效率、DNA聚合酶PCR的类型和活性以及非特异性产物的竞争。
PCR产物可分为两部分：长产物片段和短产物片段。短产物片段的长度严格限制在两条引物链的5’端之间，是待扩增的特异性片段。短产物片段和长产物片段是由于引物结合的模板不同而形成的。以一个原创模板为例。在第一个反应循环中，两个互补的DNA被用作模板。引物从3’端延伸，它的5’端是固定的，但3’端没有固定的终止子，所以长度不同。这就是所谓的“长产品碎片”。进入第二个循环后，引物不仅与原来的模板结合，还与新合成的链结合(即“长产物片段”)。当引物与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就意味着延伸片段的3’端也是固定的，这就保证了新片段的起点和终点都被限定在引物扩增序列内，形成一个长度相同的“短产物片段”。不难看出，“短产品碎片”是指数级增长，而“长产品碎片”是算术倍数增长，几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物不需要再次纯化，从而保证有足够纯的DNA片段用于分析和检测。
试剂
DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业DNA聚合酶和缓冲液、dNTP、MgSO4(任选)和DMSO(任选)
PCR反应开始前的准备工作
在PCR反应开始前，你需要准备好DNA模板(基因组DNA或反转录制备的c DNA)、特异性引物(人工设计或软件设计)并选择合适的商业DNA聚合酶(根据实验目的决定)。
1.DNA聚合酶的选择。市面上有很多种DNA聚合酶，它们的特性也各不相同。因此，你需要为你的实验选择最好的产品。我们通常把DNA聚合酶分为高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果想得到没有任何突变的PCR产物，应该选择高保真聚合酶。如果只是想判断特定序列的存在，普通的Taq聚合酶就足够了。另外需要注意的是，T载体连接的时候，要明白高保真聚合酶得到的产物是没有A端的，所以你需要在T载体连接之前加一个反应。或者可以直接使用普通的Taq聚合酶。
2.底漆。引物的特异性会影响PCR反应成功的可能性，好的引物设计对PCR的成功非常重要。设计引物时，应仔细考虑以下原则：
1.引物长度。通常，PCR引物的长度在18到22个碱基之间。这对于引物和退火温度的特异性来说是足够的。
2.熔化温度Tm。Tm值定义为半双链DNA解链成单链DNA的温度。引物的Tm值通常在52-58度之间。
3.GC含量。最合适的GC含量为40-60%。
目前有很多软件可以用来设计引物，比如primer5和Oligo。通常这些软件设计的引物就能满足需要。
步骤
准备好各种试剂和PCR仪器，就可以开始PCR实验了：将各种试剂混合，按照说明设置PCR反应。一般的PCR循环如下：
1.初始步骤：这是热启动PCR所必需的。将反应混合物加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这个步骤的时间取决于所选择的DNA聚合酶。
2.变性步骤：DNA本身是双链结构，DNA扩增需要引物和单链DNA模板的结合。在该步骤中，将反应混合物加热至94-98度，持续20-3小时。
0秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。二、PCR常见问题汇总
1. 无扩增条带
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
2. PCR产物量过少
（1） 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3） PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4） 引物量不足。增加体系中引物含量。
（5） 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6） 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7） DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4. 扩增产物出现多条带 （杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
5.阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6.条带大小与理论不符
1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
