1. 如何有效设计引物 　　

　　

　　(1)用Oligo或Primer设计引物，引物设计在保守区域，长度一般为18-27bp。上下游引物的Tm值最好为60-75，GC含量为40%-60%。引物本身之间以及引物之间不应该有互补序列，以免出现发夹结构。 　　

　　

　　2. PCR电泳无扩增条带 　　

　　

　　(1)酶失活或没有酶加入反应体系中。TaqDNA聚合酶由于储存或运输不当而失活，通常通过更换新的酶或使用其他来源的酶来获得满意的结果。 　　

　　

　　(2)模板含有杂质。尤其是甲醛固定、石蜡包埋的组织往往含有甲酸，导致DNA脱嘌呤，影响PCR的结果。 　　

　　

　　(3)变性温度是否准确：PCR仪指示的温度是否与实际温度一致，过高会在最初几个循环中使酶迅速失活；太低的模板变性不完全。 　　

　　

　　(4)反应体系被蛋白酶和核酸酶污染。加入Taq酶前，反应体系应在95加热5-10分钟。 　　

　　

　　(5)引物变质失效。合成引物是否正确。纯化，或由于不适当的储存条件而失活。 　　

　　

　　(6)底漆错误。使用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 　　

　　

　　(7)DNA凝胶电泳时，加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。 　　

　　

　　3. PCR产物量过少 　　

　　

　　(1)退火温度不合适。设计2度梯度的梯度PCR反应，优化退火温度。 　　

　　

　　(2)2)DNA模板的量太少。增加DNA模板的量。 　　

　　

　　(3)PCR循环次数不足。增加反应循环次数。 　　

　　

　　(4)底漆量不足。增加系统中的底漆含量。 　　

　　

　　(5)延长时间过短。按照1kb/min的原则设置延长时间。 　　

　　

　　(6)变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。 　　

　　

　　(7)抑制剂存在于7)DNA模板中。确保DNA模板是干净的 　　

　　

　　4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散 　　

　　

　　(1)酶量过高。减少酶的用量；酶的质量很差，所以从另一个来源更换酶。 　　

　　

　　(2)2)dNTP浓度过高。降低dNTP的浓度。 　　

　　

　　(3)氯化镁浓度过高。剂量可适当减少。 　　

　　

　　(4)模板太多。质粒DNA的剂量应该是50ng，而基因组DNA的剂量应该是200ng。 　　

　　

　　(5)引物浓度没有优化。引物的梯度稀释用于重复PCR反应。 　　

　　

　　(6)循环次数过多；增加模板数量，将循环次数减少到30次，缩短退火时间和延伸时间，或者切换到两个温度的PCR循环。 　　

　　

　　(7)退火温度太低。 　　

　　

　　(8)电泳系统有问题： 　　

　　

　　凝胶中缓冲液和电泳缓冲液的浓度差太大； 　　

　　

　　凝胶固化不好； 　　

　　

　　琼脂糖质量差。 　　

　　

　　(9)如果是PCR试剂盒，可以是： 　　

　　

　　运输和储存不当导致试剂盒失效； 　　

　　

　　试剂盒本身质量有问题，如引物选择不当、循环参数选择不当等。 　　

　　

　　(10)降解的旧模板放大也容易产生涂层。 　　

　　

　　5. 扩增产物出现多条带（杂带） 　　

　　

　　(1)引物量太大，引物特异性不高。应更换底漆或减少底漆的用量。 　　

　　

　　(2)循环次数过多。适当增加模板数量，减少循环次数。 　　

　　

　　(3)如果酶量过高或酶质量不好，应减少酶量或更换其他来源的酶。 　　

　　

　　(4)退火温度低，退火延伸时间长。应提高退火温度，减少变性和延伸时间，也可采用双温PCR扩增。设计2度梯度的梯度PCR反应，优化退火温度。 　　

　　

　　(5)样品处理不当。 　　

　　

　　(6)Mg2的浓度偏高，因为Mg2的浓度被适当地调节。 　　

　　

　　(7)如果是PCR试剂盒，试剂盒本身质量可能有问题。 　　

　　

　　(8)副本提前终止。经常使用非热启动聚合酶。在冰上准备反应系统或使用热启动聚合酶。 　　

　　

　　(9)反应缓冲液没有完全熔化或完全混合。确保反应缓冲液完全熔化并充分混合。 　　

　　

　　(10)引物特异性差。使用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 　　

　　

　　(11)引物太多。 　　

　　

　　(2)错误使用模板或引物。看引物会不会扩增出一些条带，模板是否正确。 　　

　　

　　3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。 　　

　　

　　6. 阴性对照出现条带 　　

　　

　　(1)初始退火温度过低，或者目标扩增产物与非目标产物的T值相差不大。尝试提高PCR温度或降低PCR以减少循环次数。 　　

　　

　　7. 条带大小与理论不符 　　

　　

　　(1)菌落和菌液可以再次作为PCR对照检测的模板，因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高的。如果仍出现上述结果，推测靶带可能是平板上连接液中未连接的载体扩增所致。进一步的质粒PCR检测可以证明目的片段是否真的连接成功。